CAJ | 학술논문

目的建立一种肝活检组织中HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)的定量检测方法.方法待检肝组织标本共21份,来源于江苏省人民医院肝脏手术患者,包括19份慢性HBV感染,其中HBeAg(+)标本10份,HBeAg(-)标本9份,4份非HBV感染为阴性对照组,取HBV DNA阳性的患者外周血作为rcDNA组.检测方法的主要步骤为肝组织经蛋白酶K和细胞裂解缓冲液消化后,用液相抽提法提取核酸,将提取的核酸溶液分为2等份.1份用特异性降解单链DNA的核酸酶加以消化,纯化后使用跨缺口引物和SYBR Green Ⅰ荧光染料进行实时荧光定量PCR分析;另1等份则用以定量检测肝细胞看家基因(β-Globin)作为样本细胞参数.检测结果的特异性主要通过PCR反应产物的序列分析及rcDNA组结果的对照进行证实,HBeAg(+)组和HBeAg(-)组cccDNA水平的差异通过两样本t检验进行分析.结果 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析显示扩增产物的碱基数为350 bp左右,DNA测序分析提示产物与目的片段的序列符合率为99%以上,且以rcDNA为对照的结果均为阴性,排除最有可能造成假阳性的rcDNA对结果的干扰.本方法对10 mg HBeAg(+)肝组织标本的cccDNA的检测阳性率为100%.血清HBeAg(+)的肝组织样本的平均HBV cccDNA水平高于HBeAb(+)的肝组织标本(P＜0.05).结论通过上述三种途径证实了本文所建立方法的特异性.应用SYBR Green Ⅰ荧光染料和β-Globin作为样本细胞参数所建立的实时荧光定量PCR方法检测肝细胞内HBV cccDNA,具有较高的特异性、敏感性,且成本较低的特点.
목적 건립일충간활검조직중HBV공개폐합배상DNA(cccDNA)적정량검측방법.방법 대검간조직표본공21빈,래원우강소성인민의원간장수술환자,포괄19빈만성HBV감염,기중HBeAg(+)표본10빈,HBeAg(-)표본9빈,4빈비HBV감염위음성대조조,취HBV DNA양성적환자외주혈작위rcDNA조.검측방법적주요보취위간조직경단백매K화세포렬해완충액소화후,용액상추제법제취핵산,장제취적핵산용액분위2등빈.1빈용특이성강해단련DNA적핵산매가이소화,순화후사용과결구인물화SYBR Green Ⅰ형광염료진행실시형광정량PCR분석;령1등빈칙용이정량검측간세포간가기인(β-Globin)작위양본세포삼수.검측결과적특이성주요통과PCR반응산물적서렬분석급rcDNA조결과적대조진행증실,HBeAg(+)조화HBeAg(-)조cccDNA수평적차이통과량양본t검험진행분석.결과 PCR산물경경지당응효전영분석현시확증산물적감기수위350 bp좌우,DNA측서분석제시산물여목적 편단적서렬부합솔위99%이상,차이rcDNA위대조적결과균위음성,배제최유가능조성가양성적rcDNA대결과적간우.본방법대10 mg HBeAg(+)간조직표본적cccDNA적검측양성솔위100%.혈청HBeAg(+)적간조직양본적평균HBV cccDNA수평고우HBeAb(+)적간조직표본(P＜0.05).결론 통과상술삼충도경증실료본문소건립방법적특이성.응용SYBR Green Ⅰ형광염료화β-Globin작위양본세포삼수소건립적실시형광정량PCR방법검측간세포내HBV cccDNA,구유교고적특이성、민감성,차성본교저적특점.