中国生化药物杂志
中國生化藥物雜誌
중국생화약물잡지
CHINESE JOURNAL OF BIOCHEMICAL PHARMACEUTICS
2005年
3期
151-155
,共5页
孙德军%杨春伟%赵轶卓%常淑芳%颜炜群
孫德軍%楊春偉%趙軼卓%常淑芳%顏煒群
손덕군%양춘위%조질탁%상숙방%안위군
岩栖蝮蛇%毒腺cDNA文库%降纤酶%序列分析
巖棲蝮蛇%毒腺cDNA文庫%降纖酶%序列分析
암서복사%독선cDNA문고%강섬매%서렬분석
目的采用链转化法和长距离PCR技术,构建岩栖蝮蛇(Gloydiussaxatilis)毒腺cDNA文库,克隆、分析降纤酶基因.方法用Trizol试剂盒从岩栖蝮蛇毒腺提取总RNA,再用oligo(dT)-生物素-链菌素-磁珠法从总RNA中分离mRNA,反转录合成cDNA第一链,长距离PCR合成第二链cDNA.回收cDNA用限制性内切酶消化产生黏性末端,色谱去除小于500bp片段,纯化的cDNA插入载体pBluescript,电转化E.coliDH5α,得到岩栖蝮蛇毒腺cDNA文库;测定制备的降纤酶上游氨基酸序列,并推导其基因序列,合成引物.从该cDNA文库克隆降纤酶基因并分析基因结构.结果岩栖蝮蛇毒腺cDNA文库的库容为2.0×106,降纤酶基因开框读码序列全长777个核苷酸,编码258个氨基酸,活性中心His65、Asp110、Ser204和6对二硫键进化上高度保守.结论该文库符合建库标准库容要求,为筛选新的目的基因和进一步基因操作提供了有效平台;克隆的降纤酶基因与GeneBank中其它蛇毒丝氨酸蛋白酶氨基酸序列同源性在86%以上.
目的採用鏈轉化法和長距離PCR技術,構建巖棲蝮蛇(Gloydiussaxatilis)毒腺cDNA文庫,剋隆、分析降纖酶基因.方法用Trizol試劑盒從巖棲蝮蛇毒腺提取總RNA,再用oligo(dT)-生物素-鏈菌素-磁珠法從總RNA中分離mRNA,反轉錄閤成cDNA第一鏈,長距離PCR閤成第二鏈cDNA.迴收cDNA用限製性內切酶消化產生黏性末耑,色譜去除小于500bp片段,純化的cDNA插入載體pBluescript,電轉化E.coliDH5α,得到巖棲蝮蛇毒腺cDNA文庫;測定製備的降纖酶上遊氨基痠序列,併推導其基因序列,閤成引物.從該cDNA文庫剋隆降纖酶基因併分析基因結構.結果巖棲蝮蛇毒腺cDNA文庫的庫容為2.0×106,降纖酶基因開框讀碼序列全長777箇覈苷痠,編碼258箇氨基痠,活性中心His65、Asp110、Ser204和6對二硫鍵進化上高度保守.結論該文庫符閤建庫標準庫容要求,為篩選新的目的基因和進一步基因操作提供瞭有效平檯;剋隆的降纖酶基因與GeneBank中其它蛇毒絲氨痠蛋白酶氨基痠序列同源性在86%以上.
목적채용련전화법화장거리PCR기술,구건암서복사(Gloydiussaxatilis)독선cDNA문고,극륭、분석강섬매기인.방법용Trizol시제합종암서복사독선제취총RNA,재용oligo(dT)-생물소-련균소-자주법종총RNA중분리mRNA,반전록합성cDNA제일련,장거리PCR합성제이련cDNA.회수cDNA용한제성내절매소화산생점성말단,색보거제소우500bp편단,순화적cDNA삽입재체pBluescript,전전화E.coliDH5α,득도암서복사독선cDNA문고;측정제비적강섬매상유안기산서렬,병추도기기인서렬,합성인물.종해cDNA문고극륭강섬매기인병분석기인결구.결과암서복사독선cDNA문고적고용위2.0×106,강섬매기인개광독마서렬전장777개핵감산,편마258개안기산,활성중심His65、Asp110、Ser204화6대이류건진화상고도보수.결론해문고부합건고표준고용요구,위사선신적목적기인화진일보기인조작제공료유효평태;극륭적강섬매기인여GeneBank중기타사독사안산단백매안기산서렬동원성재86%이상.
