生物技术通报
生物技術通報
생물기술통보
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
2012年
3期
153-158,165
,共7页
SUA41%融合蛋白%蛋白纯化%兔抗血清
SUA41%融閤蛋白%蛋白純化%兔抗血清
SUA41%융합단백%단백순화%토항혈청
旨在制备特异性SUA41多克隆抗体,为深入研究其在植物生长发育中的功能提供有力的分子生物学和生物化学的工具.PCR扩增拟南芥SUA41基因中编码280个氨基酸(401-680位氨基酸)的特异片段,经过GATEWAY的DNA重组技术构建了原核表达载体pDEST17-SUA41,用热休克法转化到E.coli BL21(DE3)star感受态细胞,以异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达出6×His-SUA41融合蛋白,用8 mol/L尿素缓冲液溶解包涵体并且经过水运级去除尿素获得提纯的融合蛋白,并利用Western blotting鉴定确认.融合蛋白经Ni金属螯合柱亲和层析得以纯化,用SDS-PAGE进一步纯化.纯化的融合蛋白经过SDS-PAGE后切胶回收,免疫小白兔,制备多抗血清,然后用Western blotting进行检测,鉴定血清特异性和效价.结果显示,融合蛋白6×His-SUA41免疫兔,产生特异性的SUA41兔抗血清,可以检测到细菌和拟南芥组织中SUA41蛋白.用水提纯变性剂尿素溶解的包涵体蛋白具有可行性.制备的特异性SUA41兔抗血清效价高,能够有效地识别大肠杆菌表达的和拟南芥的SUA41蛋白.在有合适的对照情况下,该兔抗血清可以用于分析植物中SUA41蛋白的功能.
旨在製備特異性SUA41多剋隆抗體,為深入研究其在植物生長髮育中的功能提供有力的分子生物學和生物化學的工具.PCR擴增擬南芥SUA41基因中編碼280箇氨基痠(401-680位氨基痠)的特異片段,經過GATEWAY的DNA重組技術構建瞭原覈錶達載體pDEST17-SUA41,用熱休剋法轉化到E.coli BL21(DE3)star感受態細胞,以異丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導錶達齣6×His-SUA41融閤蛋白,用8 mol/L尿素緩遲液溶解包涵體併且經過水運級去除尿素穫得提純的融閤蛋白,併利用Western blotting鑒定確認.融閤蛋白經Ni金屬螯閤柱親和層析得以純化,用SDS-PAGE進一步純化.純化的融閤蛋白經過SDS-PAGE後切膠迴收,免疫小白兔,製備多抗血清,然後用Western blotting進行檢測,鑒定血清特異性和效價.結果顯示,融閤蛋白6×His-SUA41免疫兔,產生特異性的SUA41兔抗血清,可以檢測到細菌和擬南芥組織中SUA41蛋白.用水提純變性劑尿素溶解的包涵體蛋白具有可行性.製備的特異性SUA41兔抗血清效價高,能夠有效地識彆大腸桿菌錶達的和擬南芥的SUA41蛋白.在有閤適的對照情況下,該兔抗血清可以用于分析植物中SUA41蛋白的功能.
지재제비특이성SUA41다극륭항체,위심입연구기재식물생장발육중적공능제공유력적분자생물학화생물화학적공구.PCR확증의남개SUA41기인중편마280개안기산(401-680위안기산)적특이편단,경과GATEWAY적DNA중조기술구건료원핵표체재체pDEST17-SUA41,용열휴극법전화도E.coli BL21(DE3)star감수태세포,이이병기β-D-류대반유당감(IPTG)유도표체출6×His-SUA41융합단백,용8 mol/L뇨소완충액용해포함체병차경과수운급거제뇨소획득제순적융합단백,병이용Western blotting감정학인.융합단백경Ni금속오합주친화층석득이순화,용SDS-PAGE진일보순화.순화적융합단백경과SDS-PAGE후절효회수,면역소백토,제비다항혈청,연후용Western blotting진행검측,감정혈청특이성화효개.결과현시,융합단백6×His-SUA41면역토,산생특이성적SUA41토항혈청,가이검측도세균화의남개조직중SUA41단백.용수제순변성제뇨소용해적포함체단백구유가행성.제비적특이성SUA41토항혈청효개고,능구유효지식별대장간균표체적화의남개적SUA41단백.재유합괄적대조정황하,해토항혈청가이용우분석식물중SUA41단백적공능.
