CAJ | 학술논문

目的构建基于TAT技术的p38 MAPK蛋白转运系统并对导入细胞的融合蛋白的功能进行鉴定.方法采用亚克隆方法构建重组质粒pHis-TAT-p38和pHis-TAT-p38(AF)无活性突变体,并诱导原核表达纯化融合蛋白;将这两种蛋白加入培养的ECV304细胞,在高渗刺激下,通过检测p38底物ATF2的磷酸化水平,以观察由TAT转导进入细胞His-TAT-p38及其无活性突变体对内源性p38活性的影响.结果酶切和测序结果表明,载体构建正确;SDS-PAGE凝胶电泳可见原核表达纯化得到高纯度目的蛋白;Westemblot表明,融合蛋白His-TAT-p38及其突变体能够以一种时间和浓度依赖性方式高效转导进入细胞;导入His-TAT-p38蛋白后,结果发现导入的野生型p38可增强内源性p38的功能,而无活性突变体则竞争性抑制了内源性p38MAPK蛋白的功能,从而阻止或抑制其对内源性底物ATF2的磷酸化,使得信号不能传递下去,进而抑制p38 MAPK通路的活动.结论成功建立了基于TAT的蛋白转运系统,并证实TAT能够以浓度和时间依赖方式高效转运蛋白进入真核细胞;进入细胞的His-TAT-p38和His-TAT-p38无活性突变体蛋白均具有较高的生物学活性,在高渗刺激作用下前者可以增加p38磷酸化水平,而后者则显著抑制p38信号通路的活性.
목적구건기우TAT기술적p38 MAPK단백전운계통병대도입세포적융합단백적공능진행감정.방법채용아극륭방법구건중조질립pHis-TAT-p38화pHis-TAT-p38(AF)무활성돌변체,병유도원핵표체순화융합단백;장저량충단백가입배양적ECV304세포,재고삼자격하,통과검측p38저물ATF2적린산화수평,이관찰유TAT전도진입세포His-TAT-p38급기무활성돌변체대내원성p38활성적영향.결과매절화측서결과표명,재체구건정학;SDS-PAGE응효전영가견원핵표체순화득도고순도목적단백;Westemblot표명,융합단백His-TAT-p38급기돌변체능구이일충시간화농도의뢰성방식고효전도진입세포;도입His-TAT-p38단백후,결과발현도입적야생형p38가증강내원성p38적공능,이무활성돌변체칙경쟁성억제료내원성p38MAPK단백적공능,종이조지혹억제기대내원성저물ATF2적린산화,사득신호불능전체하거,진이억제p38 MAPK통로적활동.결론성공건립료기우TAT적단백전운계통,병증실TAT능구이농도화시간의뢰방식고효전운단백진입진핵세포;진입세포적His-TAT-p38화His-TAT-p38무활성돌변체단백균구유교고적생물학활성,재고삼자격작용하전자가이증가p38린산화수평,이후자칙현저억제p38신호통로적활성.