GnRH(gonadotropin-releasing hormone)是下丘脑-垂体-性腺轴中重要的十肽信息分子,在所有的脊椎动物的生殖神经内分泌调控中具有重要的作用.GnRH成熟的十肽沿着轴突被运送到下丘脑正中隆起(median eminence)末端,然后进入下丘脑垂体门脉循环(hypothalamo hypophyseal portal circulation)(四足动物)或直接通过轴突末梢(大多数硬骨鱼)把信号传递给刺激性腺的细胞,与特异性受体结合,刺激促性腺激素(GtHs,gonadotropins)的合成与释放,参与脊椎动物繁殖的起始和维持正常生殖功能.伴随着GnRH的研究,研究者对鱼类GnRH受体的研究也越来越感兴趣,牙鲆(Paralichthys olivaceus)是中国重要的海水养殖鱼类,本研究从牙鲆脑组织中克隆得到全长的TypeⅠ GnRH受体,并对其组织特异性表达作了分析,为牙鲆的神经生殖内分泌研究奠定了一定的基础.在本研究中,以海水养殖牙鲆为材料,从牙鲆脑组织中采用巢式PCR、5'-和3'-RACE技术克隆得到了1 671 bp牙鲆促性腺激素释放激素受体(GnRH-R)全长cDNA序列,包括147 bp的5'-UTR、1 248 bp的开放阅读框和276 bp的3'-UTR,GenBank登录号是DQ011872.牙鲆GnRH-R和其他物种GnRH-R的氨基酸序列的多序列比对结果显示,其存在许多保守的特征,牙鲆GnRH-R显示有3个主要的功能区域:1个N端胞外结构域(1～44个氨基酸残基)、1个大的跨膜结构域(45～324个氨基酸残基)和1个C端细胞质区域(325～415个氨基酸残基).空间结构预测显示牙鲆GnRH-R跨膜区域包含7个高度保守的跨膜α螺旋(45-64、76-95、114-135、156-176、207-224、267-286、305-324),这些α螺旋是受体锚定到细胞膜上必需的.氨基酸序列系统进化分析表明,牙鲆GnRH-R与琥珀鱼GnRH-R1具有高度同源性(85%同源性).已知的硬骨鱼GnRH-R基因的系统进化分析表明,存在两种类型的GnRH-R基因:Type Ⅰ GnRH-R和TpyeⅡGnRH-R基因.在牙鲆GnRH-R的氨基酸序列中,具有Type Ⅰ GnRH-R共有的典型基序:CAFVT(TM Ⅲ)和DLEGKVSHSLTH(TM Ⅶ开始的序列处),表明克隆得到的牙鲆GnRH-R属于Type Ⅰ GnRH-R.GnRH-R跨膜α螺旋之间的区域形成了胞内或胞外loops,这些区域参与受体信号转导和肽选择性功能上.牙鲆GnRH-R在TMⅢ的细胞质边界处具有一个保守的DRQSAI(DRⅩⅩⅪ/Ⅴ)基序,这个基序被认为参与G蛋白偶联信号转导和GnRH肽诱导受体的激活;另一个保守的区域是位于TMⅦ内的NPXXY或DPXXY基序同样存在于牙鲆中(DPVIY),这个基序参与到一些GPCRs(包括GnRH-R)的内在化(internalization),同时这个基序特别是基序中的Tyr残基对于受体激活和信号转导起到关键作用.在第三个胞内loop中,鱼类GnRH-R有个保守的Ala残基(在牙鲆中为Ala258),其也在G蛋白偶联和受体内在化方面具有重要作用.在哺乳动物或非哺乳动物GnRH-R中,在第一个和第二个胞外loop之间由2个Cys形成1个保守二硫桥,是受体的正确折叠必需的.和其他的GnRH-R一样,牙鲆GnRH-R在第一个和第二个胞外loop之间存在由2个Cys(Cys112和Cys190)可以形成的潜在的二硫桥.这个二硫桥的完全缺失将会影响受体的结构完整性和降低鱼类GnRH-R对GnRH肽的选择性.GnRH-Rs的NH2-末端区域不是很保守,但含有糖基化位点,是GnRH-Rs表达、GnRH-Rs穿梭到细胞胞表面或受体稳定必需的.将mouse的GnRH-R糖基化位点引进到人GnRH-R中,可以增加受体的数量,但不影响受体结合力或肽选择性[25-26].牙鲆Type Ⅰ GnRH-R中在NH2-末端含有3个潜在的糖基化位点(N11SSW、N15GSS和N22WTA),此外,在第一个胞外loop和第二个胞外loop中分别存在1个糖基化位点(N100ITV和N178VTI),牙鲆Type Ⅰ GnRH-R含有的糖基化位点比哺乳动物要多,牙鲆糖基化位点的数目是否/怎样影响牙鲆GnRH-R的表达、降解率或亲和力,应该进一步研究.在牙鲆GnRH-R的第一个胞内loop中,存在1个和tGnRH-RⅢ基序(80KRKSH84)一致的基序(69KRKSH74),这个基序是Gs识别基序(BBXXB,B代表碱性氨基酸,X代表任何一种氨基酸).已经证明这个基序和cAMP产生相关,cGnRH-Ⅱ能通过cAMP-PKA途径提高stbGnRH-R在COS7细胞中的活性.和其他非哺乳动物GnRH-Rs相似,牙鲆GnRH-R含有1个C-末端细胞内尾巴.这种胞内尾巴是鱼类GnRH-Rs功能必需的,在第三个胞内loop中,牙鲆GnRH-R含有2个PKC磷酸化位点(233SKR235和262TLK264);在C端尾巴中,存在1个PKC磷酸化位点(402TAR404).牙鲆GnRH-RC-末端尾巴中含有鱼类GnRH-R具有的Src同源区3(SH3)结合区域(PxxP序列)(340PPAP),能够潜在地传送偶联的能力到丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs),GnRH通过PKC和PKA调控GtHα和LHβ转录,二者都集中于MAPK水平.RT-PCR分析表明,GnRH-R在牙鲆脑和垂体有表达,暗示牙鲆GnRH-R参与到生殖行为如产卵行为;RT-PCR也检测到牙鲆GnRH-R在卵巢和睾丸中有表达,其能与牙鲆cGnRH-Ⅱ和sbGnRH在卵巢中共表达,GnRH肽在卵巢中具有自分泌/旁分泌功能,对牙鲆卵巢中的GnRH受体可能起到调控作用.
GnRH(gonadotropin-releasing hormone)是下丘腦-垂體-性腺軸中重要的十肽信息分子,在所有的脊椎動物的生殖神經內分泌調控中具有重要的作用.GnRH成熟的十肽沿著軸突被運送到下丘腦正中隆起(median eminence)末耑,然後進入下丘腦垂體門脈循環(hypothalamo hypophyseal portal circulation)(四足動物)或直接通過軸突末梢(大多數硬骨魚)把信號傳遞給刺激性腺的細胞,與特異性受體結閤,刺激促性腺激素(GtHs,gonadotropins)的閤成與釋放,參與脊椎動物繁殖的起始和維持正常生殖功能.伴隨著GnRH的研究,研究者對魚類GnRH受體的研究也越來越感興趣,牙鲆(Paralichthys olivaceus)是中國重要的海水養殖魚類,本研究從牙鲆腦組織中剋隆得到全長的TypeⅠ GnRH受體,併對其組織特異性錶達作瞭分析,為牙鲆的神經生殖內分泌研究奠定瞭一定的基礎.在本研究中,以海水養殖牙鲆為材料,從牙鲆腦組織中採用巢式PCR、5'-和3'-RACE技術剋隆得到瞭1 671 bp牙鲆促性腺激素釋放激素受體(GnRH-R)全長cDNA序列,包括147 bp的5'-UTR、1 248 bp的開放閱讀框和276 bp的3'-UTR,GenBank登錄號是DQ011872.牙鲆GnRH-R和其他物種GnRH-R的氨基痠序列的多序列比對結果顯示,其存在許多保守的特徵,牙鲆GnRH-R顯示有3箇主要的功能區域:1箇N耑胞外結構域(1～44箇氨基痠殘基)、1箇大的跨膜結構域(45～324箇氨基痠殘基)和1箇C耑細胞質區域(325～415箇氨基痠殘基).空間結構預測顯示牙鲆GnRH-R跨膜區域包含7箇高度保守的跨膜α螺鏇(45-64、76-95、114-135、156-176、207-224、267-286、305-324),這些α螺鏇是受體錨定到細胞膜上必需的.氨基痠序列繫統進化分析錶明,牙鲆GnRH-R與琥珀魚GnRH-R1具有高度同源性(85%同源性).已知的硬骨魚GnRH-R基因的繫統進化分析錶明,存在兩種類型的GnRH-R基因:Type Ⅰ GnRH-R和TpyeⅡGnRH-R基因.在牙鲆GnRH-R的氨基痠序列中,具有Type Ⅰ GnRH-R共有的典型基序:CAFVT(TM Ⅲ)和DLEGKVSHSLTH(TM Ⅶ開始的序列處),錶明剋隆得到的牙鲆GnRH-R屬于Type Ⅰ GnRH-R.GnRH-R跨膜α螺鏇之間的區域形成瞭胞內或胞外loops,這些區域參與受體信號轉導和肽選擇性功能上.牙鲆GnRH-R在TMⅢ的細胞質邊界處具有一箇保守的DRQSAI(DRⅩⅩⅪ/Ⅴ)基序,這箇基序被認為參與G蛋白偶聯信號轉導和GnRH肽誘導受體的激活;另一箇保守的區域是位于TMⅦ內的NPXXY或DPXXY基序同樣存在于牙鲆中(DPVIY),這箇基序參與到一些GPCRs(包括GnRH-R)的內在化(internalization),同時這箇基序特彆是基序中的Tyr殘基對于受體激活和信號轉導起到關鍵作用.在第三箇胞內loop中,魚類GnRH-R有箇保守的Ala殘基(在牙鲆中為Ala258),其也在G蛋白偶聯和受體內在化方麵具有重要作用.在哺乳動物或非哺乳動物GnRH-R中,在第一箇和第二箇胞外loop之間由2箇Cys形成1箇保守二硫橋,是受體的正確摺疊必需的.和其他的GnRH-R一樣,牙鲆GnRH-R在第一箇和第二箇胞外loop之間存在由2箇Cys(Cys112和Cys190)可以形成的潛在的二硫橋.這箇二硫橋的完全缺失將會影響受體的結構完整性和降低魚類GnRH-R對GnRH肽的選擇性.GnRH-Rs的NH2-末耑區域不是很保守,但含有糖基化位點,是GnRH-Rs錶達、GnRH-Rs穿梭到細胞胞錶麵或受體穩定必需的.將mouse的GnRH-R糖基化位點引進到人GnRH-R中,可以增加受體的數量,但不影響受體結閤力或肽選擇性[25-26].牙鲆Type Ⅰ GnRH-R中在NH2-末耑含有3箇潛在的糖基化位點(N11SSW、N15GSS和N22WTA),此外,在第一箇胞外loop和第二箇胞外loop中分彆存在1箇糖基化位點(N100ITV和N178VTI),牙鲆Type Ⅰ GnRH-R含有的糖基化位點比哺乳動物要多,牙鲆糖基化位點的數目是否/怎樣影響牙鲆GnRH-R的錶達、降解率或親和力,應該進一步研究.在牙鲆GnRH-R的第一箇胞內loop中,存在1箇和tGnRH-RⅢ基序(80KRKSH84)一緻的基序(69KRKSH74),這箇基序是Gs識彆基序(BBXXB,B代錶堿性氨基痠,X代錶任何一種氨基痠).已經證明這箇基序和cAMP產生相關,cGnRH-Ⅱ能通過cAMP-PKA途徑提高stbGnRH-R在COS7細胞中的活性.和其他非哺乳動物GnRH-Rs相似,牙鲆GnRH-R含有1箇C-末耑細胞內尾巴.這種胞內尾巴是魚類GnRH-Rs功能必需的,在第三箇胞內loop中,牙鲆GnRH-R含有2箇PKC燐痠化位點(233SKR235和262TLK264);在C耑尾巴中,存在1箇PKC燐痠化位點(402TAR404).牙鲆GnRH-RC-末耑尾巴中含有魚類GnRH-R具有的Src同源區3(SH3)結閤區域(PxxP序列)(340PPAP),能夠潛在地傳送偶聯的能力到絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs),GnRH通過PKC和PKA調控GtHα和LHβ轉錄,二者都集中于MAPK水平.RT-PCR分析錶明,GnRH-R在牙鲆腦和垂體有錶達,暗示牙鲆GnRH-R參與到生殖行為如產卵行為;RT-PCR也檢測到牙鲆GnRH-R在卵巢和睪汍中有錶達,其能與牙鲆cGnRH-Ⅱ和sbGnRH在卵巢中共錶達,GnRH肽在卵巢中具有自分泌/徬分泌功能,對牙鲆卵巢中的GnRH受體可能起到調控作用.
GnRH(gonadotropin-releasing hormone)시하구뇌-수체-성선축중중요적십태신식분자,재소유적척추동물적생식신경내분비조공중구유중요적작용.GnRH성숙적십태연착축돌피운송도하구뇌정중륭기(median eminence)말단,연후진입하구뇌수체문맥순배(hypothalamo hypophyseal portal circulation)(사족동물)혹직접통과축돌말소(대다수경골어)파신호전체급자격성선적세포,여특이성수체결합,자격촉성선격소(GtHs,gonadotropins)적합성여석방,삼여척추동물번식적기시화유지정상생식공능.반수착GnRH적연구,연구자대어류GnRH수체적연구야월래월감흥취,아평(Paralichthys olivaceus)시중국중요적해수양식어류,본연구종아평뇌조직중극륭득도전장적TypeⅠ GnRH수체,병대기조직특이성표체작료분석,위아평적신경생식내분비연구전정료일정적기출.재본연구중,이해수양식아평위재료,종아평뇌조직중채용소식PCR、5'-화3'-RACE기술극륭득도료1 671 bp아평촉성선격소석방격소수체(GnRH-R)전장cDNA서렬,포괄147 bp적5'-UTR、1 248 bp적개방열독광화276 bp적3'-UTR,GenBank등록호시DQ011872.아평GnRH-R화기타물충GnRH-R적안기산서렬적다서렬비대결과현시,기존재허다보수적특정,아평GnRH-R현시유3개주요적공능구역:1개N단포외결구역(1～44개안기산잔기)、1개대적과막결구역(45～324개안기산잔기)화1개C단세포질구역(325～415개안기산잔기).공간결구예측현시아평GnRH-R과막구역포함7개고도보수적과막α라선(45-64、76-95、114-135、156-176、207-224、267-286、305-324),저사α라선시수체묘정도세포막상필수적.안기산서렬계통진화분석표명,아평GnRH-R여호박어GnRH-R1구유고도동원성(85%동원성).이지적경골어GnRH-R기인적계통진화분석표명,존재량충류형적GnRH-R기인:Type Ⅰ GnRH-R화TpyeⅡGnRH-R기인.재아평GnRH-R적안기산서렬중,구유Type Ⅰ GnRH-R공유적전형기서:CAFVT(TM Ⅲ)화DLEGKVSHSLTH(TM Ⅶ개시적서렬처),표명극륭득도적아평GnRH-R속우Type Ⅰ GnRH-R.GnRH-R과막α라선지간적구역형성료포내혹포외loops,저사구역삼여수체신호전도화태선택성공능상.아평GnRH-R재TMⅢ적세포질변계처구유일개보수적DRQSAI(DRⅩⅩⅪ/Ⅴ)기서,저개기서피인위삼여G단백우련신호전도화GnRH태유도수체적격활;령일개보수적구역시위우TMⅦ내적NPXXY혹DPXXY기서동양존재우아평중(DPVIY),저개기서삼여도일사GPCRs(포괄GnRH-R)적내재화(internalization),동시저개기서특별시기서중적Tyr잔기대우수체격활화신호전도기도관건작용.재제삼개포내loop중,어류GnRH-R유개보수적Ala잔기(재아평중위Ala258),기야재G단백우련화수체내재화방면구유중요작용.재포유동물혹비포유동물GnRH-R중,재제일개화제이개포외loop지간유2개Cys형성1개보수이류교,시수체적정학절첩필수적.화기타적GnRH-R일양,아평GnRH-R재제일개화제이개포외loop지간존재유2개Cys(Cys112화Cys190)가이형성적잠재적이류교.저개이류교적완전결실장회영향수체적결구완정성화강저어류GnRH-R대GnRH태적선택성.GnRH-Rs적NH2-말단구역불시흔보수,단함유당기화위점,시GnRH-Rs표체、GnRH-Rs천사도세포포표면혹수체은정필수적.장mouse적GnRH-R당기화위점인진도인GnRH-R중,가이증가수체적수량,단불영향수체결합력혹태선택성[25-26].아평Type Ⅰ GnRH-R중재NH2-말단함유3개잠재적당기화위점(N11SSW、N15GSS화N22WTA),차외,재제일개포외loop화제이개포외loop중분별존재1개당기화위점(N100ITV화N178VTI),아평Type Ⅰ GnRH-R함유적당기화위점비포유동물요다,아평당기화위점적수목시부/즘양영향아평GnRH-R적표체、강해솔혹친화력,응해진일보연구.재아평GnRH-R적제일개포내loop중,존재1개화tGnRH-RⅢ기서(80KRKSH84)일치적기서(69KRKSH74),저개기서시Gs식별기서(BBXXB,B대표감성안기산,X대표임하일충안기산).이경증명저개기서화cAMP산생상관,cGnRH-Ⅱ능통과cAMP-PKA도경제고stbGnRH-R재COS7세포중적활성.화기타비포유동물GnRH-Rs상사,아평GnRH-R함유1개C-말단세포내미파.저충포내미파시어류GnRH-Rs공능필수적,재제삼개포내loop중,아평GnRH-R함유2개PKC린산화위점(233SKR235화262TLK264);재C단미파중,존재1개PKC린산화위점(402TAR404).아평GnRH-RC-말단미파중함유어류GnRH-R구유적Src동원구3(SH3)결합구역(PxxP서렬)(340PPAP),능구잠재지전송우련적능력도사렬원활화단백격매(MAPKs),GnRH통과PKC화PKA조공GtHα화LHβ전록,이자도집중우MAPK수평.RT-PCR분석표명,GnRH-R재아평뇌화수체유표체,암시아평GnRH-R삼여도생식행위여산란행위;RT-PCR야검측도아평GnRH-R재란소화고환중유표체,기능여아평cGnRH-Ⅱ화sbGnRH재란소중공표체,GnRH태재란소중구유자분비/방분비공능,대아평란소중적GnRH수체가능기도조공작용.
A full-length cDNA, encoding a GnRH receptor (GnRH-R), has been obtained from the brain of Japanese flounder (Paralichthys olivaceus). This cDNA encodes a protein of 415 amino acid residues exhibiting the typical arrangement of the Gprotein-coupled receptors with seven transmembrane domains. As already shown in other teleost fish, this protein possesses an intracellular carboxy-terminal tail, in contrast with its mammalian counterparts. In the case of Japanese flounder, this intracellular carboxy-terminal tail consists of 91 residues. Reverse transcription-polymerase chain reaction amplification products were found in the brain, the pituitary, the eyes and the ovary.
