CAJ | 학술논문

目的:Sox9基因是一种重要的早期胚胎发育相关基因,是前软骨细胞浓聚所必需的因子,其促进成骨但同时可以抑制骨骺细胞的终末分化,以延长软骨发育成熟过程,延迟软骨发育,抑制软骨细胞凋亡,有利于骨骼在生长发育阶段形成复杂的形状和结构.从骨骺干骨细胞中克隆得Sox9基因,并构建其真核表达载体.方法:实验于2007-03/07在同济医学院矫形外科实验室完成.①实验材料:出生＜24h纯系清洁级新生SD大白鼠,由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:参考游洪波等方法,采用免疫磁珠技术分离纯化具有FGFR-3特异性表面标志的大鼠骨骺干细胞,以FGFR-3抗体对骨骺干细胞的细胞爬片进行免疫细胞化学鉴定.提取骨骺干细胞总RNA,以RT-PCR方法获得Sox9基因的全长,插入pGEM(R)-T Easy Vector System克隆载体中进行序列测定,测序正确后将其亚克隆至表达载体pEGFP-IRE2构建重组复合质粒.结果:免疫组织化学证实,显微取材分离并纯化的细胞为骨骺干细胞.从骨骺干细胞中提取的总RNA经电泳可得28 s、18 s和5 s共3条带,测吸光度值为0.263 5,A 260/A 280为1.8741,说明提取的总RNA完整性较好,纯度高,符合RT-PCR的要求.PCR产物经电泳可得到约2000 bp的特异性条带,与预期大小一致.经限制性内切酶酶切图谱分析DNA序列测定证实的目的基因已经插入重组质粒,成功地构建了Sox9质粒.结论:成功地分离纯化了骨骺干细胞,克隆出Sox9基因并构建了Sox9基因的真核表达载体,为进一步研究Sox9的生物学功能及其在成软骨和成骨分化过程中的作用奠定了基础.
목적:Sox9기인시일충중요적조기배태발육상관기인,시전연골세포농취소필수적인자,기촉진성골단동시가이억제골후세포적종말분화,이연장연골발육성숙과정,연지연골발육,억제연골세포조망,유리우골격재생장발육계단형성복잡적형상화결구.종골후간골세포중극륭득Sox9기인,병구건기진핵표체재체.방법:실험우2007-03/07재동제의학원교형외과실험실완성.①실험재료:출생＜24h순계청길급신생SD대백서,유화중과기대학동제의학원실험동물중심제공,실험과정중대동물처치부합동물윤리학표준.②실험방법:삼고유홍파등방법,채용면역자주기술분리순화구유FGFR-3특이성표면표지적대서골후간세포,이FGFR-3항체대골후간세포적세포파편진행면역세포화학감정.제취골후간세포총RNA,이RT-PCR방법획득Sox9기인적전장,삽입pGEM(R)-T Easy Vector System극륭재체중진행서렬측정,측서정학후장기아극륭지표체재체pEGFP-IRE2구건중조복합질립.결과:면역조직화학증실,현미취재분리병순화적세포위골후간세포.종골후간세포중제취적총RNA경전영가득28 s、18 s화5 s공3조대,측흡광도치위0.263 5,A 260/A 280위1.8741,설명제취적총RNA완정성교호,순도고,부합RT-PCR적요구.PCR산물경전영가득도약2000 bp적특이성조대,여예기대소일치.경한제성내절매매절도보분석DNA서렬측정증실적목적기인이경삽입중조질립,성공지구건료Sox9질립.결론:성공지분리순화료골후간세포,극륭출Sox9기인병구건료Sox9기인적진핵표체재체,위진일보연구Sox9적생물학공능급기재성연골화성골분화과정중적작용전정료기출.