中国医药生物技术
中國醫藥生物技術
중국의약생물기술
CHINESE MEDICINAL BIOTECHNOLOGY
2010年
6期
438-441
,共4页
孔艳%吴小红%杨立宏%安祺%董关木%俞永新
孔豔%吳小紅%楊立宏%安祺%董關木%俞永新
공염%오소홍%양립굉%안기%동관목%유영신
聚合酶链反应%RNA指导的DNA聚合酶
聚閤酶鏈反應%RNA指導的DNA聚閤酶
취합매련반응%RNA지도적DNA취합매
目的 在传统产物增强性反转录酶(PERT)活性检测方法基础上建立检测反转录酶活性的实时荧光定量PCR方法.方法 以噬菌体MS2 RNA为模板,设计、合成引物和探针,并分别以连续10倍倍比稀释的AMV反转录酶(1×10-1～1×10-9 U/μl)标准品催化体外反转录反应合成相应cDNA.采用实时荧光定量PCR法检测底物cDNA模板量,并获得相应的PCR荧光值曲线,分析AMV反转录酶的相对活性.同时应用传统PERT方法对cDNA进行扩增,测定该方法的灵敏度.结果 将AMV反转录酶标准品连续10倍倍比稀释后催化反转录反应,实时荧光定量PCR分析所得的反转录产物cDNA,结果得到与理论值完全相符合的PCR标准荧光值曲线;定量分析结果显示,浓度为1×10-2～1×10-8U/μl的AMV反转录酶均可得到相应的荧光值.不同稀释度的AMV反转录酶,经传统PERT方法扩增后,结果显示浓度为1×10-3～1×10-7 U/μl的AMV反转录酶均可见大小为112 bp的阳性条带,检测灵敏度达到1×10-7U/μl.结论 成功建立了基于实时荧光定量PCR技术的检测反转录酶活性的新方法,实验操作简单,具有高精确性和无污染性,为生物制品外来污染尤其是反转录病毒污染的检测提供了参考指标.
目的 在傳統產物增彊性反轉錄酶(PERT)活性檢測方法基礎上建立檢測反轉錄酶活性的實時熒光定量PCR方法.方法 以噬菌體MS2 RNA為模闆,設計、閤成引物和探針,併分彆以連續10倍倍比稀釋的AMV反轉錄酶(1×10-1～1×10-9 U/μl)標準品催化體外反轉錄反應閤成相應cDNA.採用實時熒光定量PCR法檢測底物cDNA模闆量,併穫得相應的PCR熒光值麯線,分析AMV反轉錄酶的相對活性.同時應用傳統PERT方法對cDNA進行擴增,測定該方法的靈敏度.結果 將AMV反轉錄酶標準品連續10倍倍比稀釋後催化反轉錄反應,實時熒光定量PCR分析所得的反轉錄產物cDNA,結果得到與理論值完全相符閤的PCR標準熒光值麯線;定量分析結果顯示,濃度為1×10-2～1×10-8U/μl的AMV反轉錄酶均可得到相應的熒光值.不同稀釋度的AMV反轉錄酶,經傳統PERT方法擴增後,結果顯示濃度為1×10-3～1×10-7 U/μl的AMV反轉錄酶均可見大小為112 bp的暘性條帶,檢測靈敏度達到1×10-7U/μl.結論 成功建立瞭基于實時熒光定量PCR技術的檢測反轉錄酶活性的新方法,實驗操作簡單,具有高精確性和無汙染性,為生物製品外來汙染尤其是反轉錄病毒汙染的檢測提供瞭參攷指標.
목적 재전통산물증강성반전록매(PERT)활성검측방법기출상건립검측반전록매활성적실시형광정량PCR방법.방법 이서균체MS2 RNA위모판,설계、합성인물화탐침,병분별이련속10배배비희석적AMV반전록매(1×10-1～1×10-9 U/μl)표준품최화체외반전록반응합성상응cDNA.채용실시형광정량PCR법검측저물cDNA모판량,병획득상응적PCR형광치곡선,분석AMV반전록매적상대활성.동시응용전통PERT방법대cDNA진행확증,측정해방법적령민도.결과 장AMV반전록매표준품련속10배배비희석후최화반전록반응,실시형광정량PCR분석소득적반전록산물cDNA,결과득도여이론치완전상부합적PCR표준형광치곡선;정량분석결과현시,농도위1×10-2～1×10-8U/μl적AMV반전록매균가득도상응적형광치.불동희석도적AMV반전록매,경전통PERT방법확증후,결과현시농도위1×10-3～1×10-7 U/μl적AMV반전록매균가견대소위112 bp적양성조대,검측령민도체도1×10-7U/μl.결론 성공건립료기우실시형광정량PCR기술적검측반전록매활성적신방법,실험조작간단,구유고정학성화무오염성,위생물제품외래오염우기시반전록병독오염적검측제공료삼고지표.
