南通大学学报（医学版）
南通大學學報（醫學版）
남통대학학보（의학판）
JOURNAL OF NANTONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCES)
2010年
6期
423-425,封2
,共4页
刘燕%彭聿平%黄彦%黄慧伟%邱一华
劉燕%彭聿平%黃彥%黃慧偉%邱一華
류연%팽율평%황언%황혜위%구일화
微小RNA%慢病毒载体%酪氨酸羟化酶
微小RNA%慢病毒載體%酪氨痠羥化酶
미소RNA%만병독재체%락안산간화매
目的:克隆microRNA-酪氨酸羟化酶(TH),构建慢病毒载体.方法:根据TH基因序列(NM_009377.1),设计并合成4对微小RNA(miRNA)的Oligo DNA,退火形成双链后与pcDNATM 6.2-GW/EmGFP-miRNA载体相连,用Gateway技术将构建好的pcDNATM6.2-GW/ EmGFP- miR-TH载体先后与中间载体pDONRTM221、慢病毒载体pLenti6/ V5-DEST 连接,构建慢病毒表达载体pLenti6/V5-DEST-TH,用脂质体2000(lipofectamine 2000)将慢病毒载体以及包装质粒(pLP1, pLP2 和pLP/ VSVG)共转染HEK-293FT细胞,收集上清,感染293T细胞株进行滴度鉴定.结果:测序结果表明,4 对pcDNATM 6.2-GW/ EmGFP-miR-TH表达载体序列与参考序列一致, 构建出来的慢病毒载体在293FT细胞中包装成功,并通过293T细胞测得慢病毒滴度为5×106 TU/ml.结论:成功构建了TH的慢病毒干扰载体pLenti6/V5-DEST-TH,为利用RNA干扰技术进一步研究TH基因的功能和作用奠定了基础.
目的:剋隆microRNA-酪氨痠羥化酶(TH),構建慢病毒載體.方法:根據TH基因序列(NM_009377.1),設計併閤成4對微小RNA(miRNA)的Oligo DNA,退火形成雙鏈後與pcDNATM 6.2-GW/EmGFP-miRNA載體相連,用Gateway技術將構建好的pcDNATM6.2-GW/ EmGFP- miR-TH載體先後與中間載體pDONRTM221、慢病毒載體pLenti6/ V5-DEST 連接,構建慢病毒錶達載體pLenti6/V5-DEST-TH,用脂質體2000(lipofectamine 2000)將慢病毒載體以及包裝質粒(pLP1, pLP2 和pLP/ VSVG)共轉染HEK-293FT細胞,收集上清,感染293T細胞株進行滴度鑒定.結果:測序結果錶明,4 對pcDNATM 6.2-GW/ EmGFP-miR-TH錶達載體序列與參攷序列一緻, 構建齣來的慢病毒載體在293FT細胞中包裝成功,併通過293T細胞測得慢病毒滴度為5×106 TU/ml.結論:成功構建瞭TH的慢病毒榦擾載體pLenti6/V5-DEST-TH,為利用RNA榦擾技術進一步研究TH基因的功能和作用奠定瞭基礎.
목적:극륭microRNA-락안산간화매(TH),구건만병독재체.방법:근거TH기인서렬(NM_009377.1),설계병합성4대미소RNA(miRNA)적Oligo DNA,퇴화형성쌍련후여pcDNATM 6.2-GW/EmGFP-miRNA재체상련,용Gateway기술장구건호적pcDNATM6.2-GW/ EmGFP- miR-TH재체선후여중간재체pDONRTM221、만병독재체pLenti6/ V5-DEST 련접,구건만병독표체재체pLenti6/V5-DEST-TH,용지질체2000(lipofectamine 2000)장만병독재체이급포장질립(pLP1, pLP2 화pLP/ VSVG)공전염HEK-293FT세포,수집상청,감염293T세포주진행적도감정.결과:측서결과표명,4 대pcDNATM 6.2-GW/ EmGFP-miR-TH표체재체서렬여삼고서렬일치, 구건출래적만병독재체재293FT세포중포장성공,병통과293T세포측득만병독적도위5×106 TU/ml.결론:성공구건료TH적만병독간우재체pLenti6/V5-DEST-TH,위이용RNA간우기술진일보연구TH기인적공능화작용전정료기출.
