中国实验血液学杂志
中國實驗血液學雜誌
중국실험혈액학잡지
JOURNAL OF EXPERIMENTAL HEMATOLOGY
2004年
2期
188-193
,共6页
康文英%王鸿利%王红%王学锋%王从珠%傅启华%丁秋兰%武文漫%方怡%王振义
康文英%王鴻利%王紅%王學鋒%王從珠%傅啟華%丁鞦蘭%武文漫%方怡%王振義
강문영%왕홍리%왕홍%왕학봉%왕종주%부계화%정추란%무문만%방이%왕진의
逆转录病毒%聚酰胺-胺型树枝状聚合物%凝血因子Ⅷ%基因治疗
逆轉錄病毒%聚酰胺-胺型樹枝狀聚閤物%凝血因子Ⅷ%基因治療
역전록병독%취선알-알형수지상취합물%응혈인자Ⅷ%기인치료
本研究观察逆转录病毒载体和聚酰胺-胺型(PAMAM)树枝状聚合物介导的人凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因在小鼠体内的转染和表达,并与体外转染方法作比较.应用含B区缺失(760aa-1639aa)人FⅧcDNA(FⅧBD cDNA)的以逆转录病毒为框架的重组表达质粒载体pLNC-FⅧBD包装成为逆转录病毒LNC-FⅧBD,ex vivo转染小鼠骨髓基质细胞,同时将pLNC-FⅧBD与PAMAM树枝状聚合物按照1:15混合以形成复合体PAMAM-pLNC-FⅧBD进行小鼠in vivo转染.分别于注射后第24,48小时,第1,2,3,4周取血,分离血浆,采用一期法测定人FⅧ活性(FⅧ c),ELISA法测定人FⅧ抗原(FⅧAg),并采用Bethesdainhibitor assay测定人FⅧ抗体;同时取脏器肝、脾、肺、肾提取RNA,进行RT-PCR,观察各组织的转录,并用苏木素-伊红染色法观察各组织的形态学改变.结果表明,逆转录病毒转染人FⅧ基因的骨髓基质细胞输入体内后,可以在体内继续表达人FⅧ,并且能有效地分泌至血液中.宿主小鼠体内可检测到的人FⅧ表达持续3周以上,注射后第24小时表达最高水平,人FⅧAg平均为8.6 ng/ml,此后人FⅧ抗体逐渐生成,人FⅧAg水平渐低,于注射后第4周不再能测出人FⅧAg.注射复合体PAMAM-pLNC-F ⅧBD在体内转染后,获得了短暂的人FⅧ生理水平的表达,在注射后第48小时表达水平最高,人FⅧc和FⅧAg 的平均水平分别为0.62U/ml和115.5 ng/ml;注射后第3周平均水平降至0.042U/ml.RT-PCR结果表明,各脏器表达人FⅧ的水平不一,脾脏和肺脏表达水平高,且时间长,注射后各个时间点的小鼠血浆均未见人FⅧ抗体产生.组织病理学检查未发现小鼠各器官组织有病理改变.结论:经逆转录病毒介导的人FⅧ经ex vivo转染于BALB小鼠体内,其表达人FⅧ水平较低且该小鼠免疫原性增强,容易产生抗体;C57BL/6J小鼠在注射复合体PAMAM-pLNC-hFⅧBD(即体内转染)后可获得短暂的人FⅧ生理水平的表达,在注射后第48小时表达水平最高,至少可持续表达2周以上.
本研究觀察逆轉錄病毒載體和聚酰胺-胺型(PAMAM)樹枝狀聚閤物介導的人凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因在小鼠體內的轉染和錶達,併與體外轉染方法作比較.應用含B區缺失(760aa-1639aa)人FⅧcDNA(FⅧBD cDNA)的以逆轉錄病毒為框架的重組錶達質粒載體pLNC-FⅧBD包裝成為逆轉錄病毒LNC-FⅧBD,ex vivo轉染小鼠骨髓基質細胞,同時將pLNC-FⅧBD與PAMAM樹枝狀聚閤物按照1:15混閤以形成複閤體PAMAM-pLNC-FⅧBD進行小鼠in vivo轉染.分彆于註射後第24,48小時,第1,2,3,4週取血,分離血漿,採用一期法測定人FⅧ活性(FⅧ c),ELISA法測定人FⅧ抗原(FⅧAg),併採用Bethesdainhibitor assay測定人FⅧ抗體;同時取髒器肝、脾、肺、腎提取RNA,進行RT-PCR,觀察各組織的轉錄,併用囌木素-伊紅染色法觀察各組織的形態學改變.結果錶明,逆轉錄病毒轉染人FⅧ基因的骨髓基質細胞輸入體內後,可以在體內繼續錶達人FⅧ,併且能有效地分泌至血液中.宿主小鼠體內可檢測到的人FⅧ錶達持續3週以上,註射後第24小時錶達最高水平,人FⅧAg平均為8.6 ng/ml,此後人FⅧ抗體逐漸生成,人FⅧAg水平漸低,于註射後第4週不再能測齣人FⅧAg.註射複閤體PAMAM-pLNC-F ⅧBD在體內轉染後,穫得瞭短暫的人FⅧ生理水平的錶達,在註射後第48小時錶達水平最高,人FⅧc和FⅧAg 的平均水平分彆為0.62U/ml和115.5 ng/ml;註射後第3週平均水平降至0.042U/ml.RT-PCR結果錶明,各髒器錶達人FⅧ的水平不一,脾髒和肺髒錶達水平高,且時間長,註射後各箇時間點的小鼠血漿均未見人FⅧ抗體產生.組織病理學檢查未髮現小鼠各器官組織有病理改變.結論:經逆轉錄病毒介導的人FⅧ經ex vivo轉染于BALB小鼠體內,其錶達人FⅧ水平較低且該小鼠免疫原性增彊,容易產生抗體;C57BL/6J小鼠在註射複閤體PAMAM-pLNC-hFⅧBD(即體內轉染)後可穫得短暫的人FⅧ生理水平的錶達,在註射後第48小時錶達水平最高,至少可持續錶達2週以上.
본연구관찰역전록병독재체화취선알-알형(PAMAM)수지상취합물개도적인응혈인자Ⅷ(FⅧ)기인재소서체내적전염화표체,병여체외전염방법작비교.응용함B구결실(760aa-1639aa)인FⅧcDNA(FⅧBD cDNA)적이역전록병독위광가적중조표체질립재체pLNC-FⅧBD포장성위역전록병독LNC-FⅧBD,ex vivo전염소서골수기질세포,동시장pLNC-FⅧBD여PAMAM수지상취합물안조1:15혼합이형성복합체PAMAM-pLNC-FⅧBD진행소서in vivo전염.분별우주사후제24,48소시,제1,2,3,4주취혈,분리혈장,채용일기법측정인FⅧ활성(FⅧ c),ELISA법측정인FⅧ항원(FⅧAg),병채용Bethesdainhibitor assay측정인FⅧ항체;동시취장기간、비、폐、신제취RNA,진행RT-PCR,관찰각조직적전록,병용소목소-이홍염색법관찰각조직적형태학개변.결과표명,역전록병독전염인FⅧ기인적골수기질세포수입체내후,가이재체내계속표체인FⅧ,병차능유효지분비지혈액중.숙주소서체내가검측도적인FⅧ표체지속3주이상,주사후제24소시표체최고수평,인FⅧAg평균위8.6 ng/ml,차후인FⅧ항체축점생성,인FⅧAg수평점저,우주사후제4주불재능측출인FⅧAg.주사복합체PAMAM-pLNC-F ⅧBD재체내전염후,획득료단잠적인FⅧ생리수평적표체,재주사후제48소시표체수평최고,인FⅧc화FⅧAg 적평균수평분별위0.62U/ml화115.5 ng/ml;주사후제3주평균수평강지0.042U/ml.RT-PCR결과표명,각장기표체인FⅧ적수평불일,비장화폐장표체수평고,차시간장,주사후각개시간점적소서혈장균미견인FⅧ항체산생.조직병이학검사미발현소서각기관조직유병리개변.결론:경역전록병독개도적인FⅧ경ex vivo전염우BALB소서체내,기표체인FⅧ수평교저차해소서면역원성증강,용역산생항체;C57BL/6J소서재주사복합체PAMAM-pLNC-hFⅧBD(즉체내전염)후가획득단잠적인FⅧ생리수평적표체,재주사후제48소시표체수평최고,지소가지속표체2주이상.
