CAJ | 학술논문

通过DEAE-Sephadex A-50离子交换层析和Sephacryl S-200分子筛层析并采用抑菌活性和SDS-PAGE跟踪检测,从多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)WY110菌株中分离纯化到一种对稻瘟病菌具有拮抗活性的抗菌蛋白P2(分子量约26 kD).平板抑菌试验表明,在PDA培养基上1.5 μg 纯化的P2蛋白即可有效地抑制稻瘟病菌菌丝生长,并对所测试的稻瘟病菌不同菌株均表现出抑菌活性.对P2蛋白的N-端测序结果表明,N-末端24个氨基酸序列为H2N-Ala-Asn-Val-Phe-Trp-Glu-Pro-Leu-Ser-Tyr-Tyr-Asn-Pro-Ser-Thr-Trp-Gln-Lys-Ala-Asp-Gly-Tyr-Ser-Asn-.以此为靶序列在网上用BlastP程序对蛋白质序列数据库进行了类似性检索,发现其与来源于芽孢杆菌的β-1,3-1,4-葡聚糖酶前体具有很高的同源性.进一步用此酶的特异底物地衣多糖进行了定性检测,验证了P2蛋白具有β-1,3-1,4-葡聚糖酶的活性.在此基础上,根据P2蛋白N-末端氨基酸序列及此酶C-端保守性序列设计合成了两端引物,以WY110基因组DNA为模板,通过PCR高保真扩增获得了P2蛋白编码基因的全序列,并克隆到pMD18-T载体上.核苷酸序列分析表明,其5′端72个核苷酸序列与蛋白N-端已知的24个氨基酸序列完全吻合,序列全长为636 bp (GenBank登录号:AF284449),编码212个氨基酸;与已报道的一例来源于Paenibacillus polymyxa的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(gluB)相比,核苷酸和氨基酸序列同源性分别为84%和88.7%.β-1,3-1,4-葡聚糖酶具有抗稻瘟病菌活性尚未见报道.P2蛋白编码基因的克隆为水稻抗病基因工程提供了有潜在应用价值的新的目的基因.
통과DEAE-Sephadex A-50리자교환층석화Sephacryl S-200분자사층석병채용억균활성화SDS-PAGE근종검측,종다점류아포간균(Paenibacillus polymyxa)WY110균주중분리순화도일충대도온병균구유길항활성적항균단백P2(분자량약26 kD).평판억균시험표명,재PDA배양기상1.5 μg 순화적P2단백즉가유효지억제도온병균균사생장,병대소측시적도온병균불동균주균표현출억균활성.대P2단백적N-단측서결과표명,N-말단24개안기산서렬위H2N-Ala-Asn-Val-Phe-Trp-Glu-Pro-Leu-Ser-Tyr-Tyr-Asn-Pro-Ser-Thr-Trp-Gln-Lys-Ala-Asp-Gly-Tyr-Ser-Asn-.이차위파서렬재망상용BlastP정서대단백질서렬수거고진행료유사성검색,발현기여래원우아포간균적β-1,3-1,4-포취당매전체구유흔고적동원성.진일보용차매적특이저물지의다당진행료정성검측,험증료P2단백구유β-1,3-1,4-포취당매적활성.재차기출상,근거P2단백N-말단안기산서렬급차매C-단보수성서렬설계합성료량단인물,이WY110기인조DNA위모판,통과PCR고보진확증획득료P2단백편마기인적전서렬,병극륭도pMD18-T재체상.핵감산서렬분석표명,기5′단72개핵감산서렬여단백N-단이지적24개안기산서렬완전문합,서렬전장위636 bp (GenBank등록호:AF284449),편마212개안기산;여이보도적일례래원우Paenibacillus polymyxa적β-1,3-1,4-포취당매기인(gluB)상비,핵감산화안기산서렬동원성분별위84%화88.7%.β-1,3-1,4-포취당매구유항도온병균활성상미견보도.P2단백편마기인적극륭위수도항병기인공정제공료유잠재응용개치적신적목적기인.