江苏农业学报
江囌農業學報
강소농업학보
JIANGSU JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCES
2011年
2期
329-336
,共8页
周红梅%王颖%张立凡%华绪川%王争光%徐宁迎%郭晓令
週紅梅%王穎%張立凡%華緒川%王爭光%徐寧迎%郭曉令
주홍매%왕영%장립범%화서천%왕쟁광%서저영%곽효령
fat-1基因%密码子优化%转染%家兔胎儿成纤维细胞
fat-1基因%密碼子優化%轉染%傢兔胎兒成纖維細胞
fat-1기인%밀마자우화%전염%가토태인성섬유세포
根据家兔基因密码子使用偏好性,对引自GenBank的秀丽隐杆线虫fat-1基因编码序列进行密码子优化,通过全基因合成的方法获得优化后的fat-1基因(命名为opfat-1);从秀丽隐杆线虫中RT-PCR扩增获得fat-1.将扩增的fat-1和合成的opfat-1基因分别构建到绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1中.采用脂质体LipofectamineTM转染法将fat-1和opfat-1基因转入家兔胎儿成纤维细胞(Rabbit fetal fibroblast cells,rFFCs)中.对比不同DNA和转染试剂用量以及细胞暴露于DNA、转染试剂中作用时间探讨影响rFFCs转染效率的参数,经过优化,最优的rFFCs转染条件为:LipofectamineTM用量2～3μl,DNA量0.8～1.0μg,LipofectamineTM与DNA、细胞共培养时间为8 h.通过绿色荧光标记和RT-PCR检测转染细胞中融合蛋白和目的基因的表达.密码子优化的opfat-1与fat-1相比,体外瞬时表达效率有极为显著的提高;G418抗性筛选获得转基因单克隆细胞,RT-PCR初步验证fat-1和opfat-1基因均在家兔胎儿成纤维细胞中稳定转录表达.
根據傢兔基因密碼子使用偏好性,對引自GenBank的秀麗隱桿線蟲fat-1基因編碼序列進行密碼子優化,通過全基因閤成的方法穫得優化後的fat-1基因(命名為opfat-1);從秀麗隱桿線蟲中RT-PCR擴增穫得fat-1.將擴增的fat-1和閤成的opfat-1基因分彆構建到綠色熒光蛋白真覈錶達載體pEGFP-C1中.採用脂質體LipofectamineTM轉染法將fat-1和opfat-1基因轉入傢兔胎兒成纖維細胞(Rabbit fetal fibroblast cells,rFFCs)中.對比不同DNA和轉染試劑用量以及細胞暴露于DNA、轉染試劑中作用時間探討影響rFFCs轉染效率的參數,經過優化,最優的rFFCs轉染條件為:LipofectamineTM用量2～3μl,DNA量0.8～1.0μg,LipofectamineTM與DNA、細胞共培養時間為8 h.通過綠色熒光標記和RT-PCR檢測轉染細胞中融閤蛋白和目的基因的錶達.密碼子優化的opfat-1與fat-1相比,體外瞬時錶達效率有極為顯著的提高;G418抗性篩選穫得轉基因單剋隆細胞,RT-PCR初步驗證fat-1和opfat-1基因均在傢兔胎兒成纖維細胞中穩定轉錄錶達.
근거가토기인밀마자사용편호성,대인자GenBank적수려은간선충fat-1기인편마서렬진행밀마자우화,통과전기인합성적방법획득우화후적fat-1기인(명명위opfat-1);종수려은간선충중RT-PCR확증획득fat-1.장확증적fat-1화합성적opfat-1기인분별구건도록색형광단백진핵표체재체pEGFP-C1중.채용지질체LipofectamineTM전염법장fat-1화opfat-1기인전입가토태인성섬유세포(Rabbit fetal fibroblast cells,rFFCs)중.대비불동DNA화전염시제용량이급세포폭로우DNA、전염시제중작용시간탐토영향rFFCs전염효솔적삼수,경과우화,최우적rFFCs전염조건위:LipofectamineTM용량2～3μl,DNA량0.8～1.0μg,LipofectamineTM여DNA、세포공배양시간위8 h.통과록색형광표기화RT-PCR검측전염세포중융합단백화목적기인적표체.밀마자우화적opfat-1여fat-1상비,체외순시표체효솔유겁위현저적제고;G418항성사선획득전기인단극륭세포,RT-PCR초보험증fat-1화opfat-1기인균재가토태인성섬유세포중은정전록표체.
