CAJ | 학술논문

目的构建华支睾吸虫成虫转录辅激活因子(transcriptional coactivator, TC)基因(TC基因)原核重组质粒, 进行原核表达、鉴定及生物功能分析. 方法根据TC基因已知序列设计1 对引物, 从华支睾吸虫成虫 cDNA 文库中扩增TC基因片段;将目的基因进行聚合酶链反应(PCR), 其产物和空质粒pGEX-4T-1、pET30a(+)同时用限制性内切酶 BamHⅠ、 SalⅠ双酶切, 纯化回收后连接并转化大肠埃希菌( E.coli BL21).将构建的重组质粒pGEX-4T-1-TC和pET30a(+)-TC分别经双酶切、PCR及测序鉴定后在大肠埃希菌BL21中诱导表达.用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western blotting)鉴定其表达效果, 用亲和层析法纯化重组质粒pET30a(+)-TC表达产生的组氨酸重组蛋白(His-TC). 结果构建了TC基因原核重组质粒pGEX-4T-1-TC和pET30a(+)-TC.SDS-PAGE 结果表明TC基因在大肠埃希菌BL21 系统获得高效表达, 其重组蛋白分子量与理论值相符. Western blotting 结果表明重组质粒pGEX-4T-1-TC表达的谷胱甘肽硫转移酶(GST)重组蛋白(GST-TC)可被华支睾吸虫免疫兔血清识别, 具有免疫反应性. 纯化的TC基因的组氨酸(His)重组蛋白(His-TC)经SDS-PAGE显示单一条带. 结论通过生物信息学方法由华支睾吸虫成虫cDNA文库中筛选出TC基因, 并成功予以克隆、表达及纯化.
목적구건화지고흡충성충전록보격활인자(transcriptional coactivator, TC)기인(TC기인)원핵중조질립, 진행원핵표체、감정급생물공능분석. 방법근거TC기인이지서렬설계1 대인물, 종화지고흡충성충 cDNA 문고중확증TC기인편단;장목적기인진행취합매련반응(PCR), 기산물화공질립pGEX-4T-1、pET30a(+)동시용한제성내절매 BamHⅠ、 SalⅠ쌍매절, 순화회수후련접병전화대장애희균( E.coli BL21).장구건적중조질립pGEX-4T-1-TC화pET30a(+)-TC분별경쌍매절、PCR급측서감정후재대장애희균BL21중유도표체.용십이완기광산납-취병희선알응효전영(SDS-PAGE)화단백질인적법(Western blotting)감정기표체효과, 용친화층석법순화중조질립pET30a(+)-TC표체산생적조안산중조단백(His-TC). 결과구건료TC기인원핵중조질립pGEX-4T-1-TC화pET30a(+)-TC.SDS-PAGE 결과표명TC기인재대장애희균BL21 계통획득고효표체, 기중조단백분자량여이론치상부. Western blotting 결과표명중조질립pGEX-4T-1-TC표체적곡광감태류전이매(GST)중조단백(GST-TC)가피화지고흡충면역토혈청식별, 구유면역반응성. 순화적TC기인적조안산(His)중조단백(His-TC)경SDS-PAGE현시단일조대. 결론통과생물신식학방법유화지고흡충성충cDNA문고중사선출TC기인, 병성공여이극륭、표체급순화.