CAJ | 학술논문

根据GenBank中绵羊、牛的Hairless和β-actin基因编码区保守序列,设计特异性引物,提取皮肤组织总RNA,经反转录RT-PCR扩增,产物回收纯化后与pGM-T载体连接,转化大肠杆菌感受态细胞Top10,质粒提取后经酶切、PCR和测序鉴定,获得阳性Hairless、β-actin重组质粒;将阳性重组质粒按103～107拷贝/反应梯度稀释作为模板,进行实时荧光定量PCR,系统软件自动生成标准曲线及回归方程.结果显示,产物熔解曲线峰值单一,说明引物特异性高,且无引物二聚体;Hairless和β-actin基因标准曲线相关系数分别为r2=0.998、r2=0.999,说明线性关系好.重复性试验结果显示,所构建的重组质粒9次同条件扩增Ct值具有良好的重现性,且变异率小于6%(107拷贝/反应除外),说明标准曲线重复性好.试验成功构建了目的基因Hairless内参基因β-actin的标准质粒和标准曲线,为实时荧光定量PCR检测绒山羊Hairless基因的mRNA表达水平奠定基础.
근거GenBank중면양、우적Hairless화β-actin기인편마구보수서렬,설계특이성인물,제취피부조직총RNA,경반전록RT-PCR확증,산물회수순화후여pGM-T재체련접,전화대장간균감수태세포Top10,질립제취후경매절、PCR화측서감정,획득양성Hairless、β-actin중조질립;장양성중조질립안103～107고패/반응제도희석작위모판,진행실시형광정량PCR,계통연건자동생성표준곡선급회귀방정.결과현시,산물용해곡선봉치단일,설명인물특이성고,차무인물이취체;Hairless화β-actin기인표준곡선상관계수분별위r2=0.998、r2=0.999,설명선성관계호.중복성시험결과현시,소구건적중조질립9차동조건확증Ct치구유량호적중현성,차변이솔소우6%(107고패/반응제외),설명표준곡선중복성호.시험성공구건료목적기인Hairless내삼기인β-actin적표준질립화표준곡선,위실시형광정량PCR검측융산양Hairless기인적mRNA표체수평전정기출.