华中科技大学学报（医学版）
華中科技大學學報（醫學版）
화중과기대학학보（의학판）
ACTA UNIVERSITATIS MEDICINAE TONGJI
2006年
2期
224-227,240
,共5页
廖翔%杨述华%邵增务%李进%刘勇%熊晓芊
廖翔%楊述華%邵增務%李進%劉勇%熊曉芊
료상%양술화%소증무%리진%류용%웅효천
p16ink4a基因%hRb1基因%内部核糖体插入位点%细胞周期
p16ink4a基因%hRb1基因%內部覈糖體插入位點%細胞週期
p16ink4a기인%hRb1기인%내부핵당체삽입위점%세포주기
目的应用内部核糖体插入位点(IRES)序列构建单启动子双顺反子穿梭载体pIRES-p16ink4a-hRb1并鉴定,观察其导入骨肉瘤细胞后对细胞周期的调控.方法利用基因工程技术,将p16ink4a与hRb1全长cDNA编码区依次亚克隆至pIRES载体中,质粒构建通过PCR、双酶切与测序鉴定;脂质体转染至p16ink4a表达缺失、hRb1表达阳性的骨肉瘤细胞株MG63,G418筛选获得抗性克隆,通过RT-PCR和Western blot法分析外源基因表达;流式细胞术分析细胞周期特异性和细胞凋亡率,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法与细胞生长曲线观察细胞增殖情况.结果成功构建出pIRES-p16ink4a-hRb1载体,外源基因在靶细胞mRNA和蛋白水平分别有独立表达.与对照组比较,双基因导入组细胞生长抑制率显著上升,细胞周期显著阻滞在G1期,且细胞凋亡率极显著升高.结论 pIRES-p16ink4a-hRb1双顺反子穿梭载体的构建与真核细胞导入、目的基因表达成功,为进一步研究p16ink4a与hRb1相互关系在细胞周期调控中的作用奠定了基础.
目的應用內部覈糖體插入位點(IRES)序列構建單啟動子雙順反子穿梭載體pIRES-p16ink4a-hRb1併鑒定,觀察其導入骨肉瘤細胞後對細胞週期的調控.方法利用基因工程技術,將p16ink4a與hRb1全長cDNA編碼區依次亞剋隆至pIRES載體中,質粒構建通過PCR、雙酶切與測序鑒定;脂質體轉染至p16ink4a錶達缺失、hRb1錶達暘性的骨肉瘤細胞株MG63,G418篩選穫得抗性剋隆,通過RT-PCR和Western blot法分析外源基因錶達;流式細胞術分析細胞週期特異性和細胞凋亡率,四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法與細胞生長麯線觀察細胞增殖情況.結果成功構建齣pIRES-p16ink4a-hRb1載體,外源基因在靶細胞mRNA和蛋白水平分彆有獨立錶達.與對照組比較,雙基因導入組細胞生長抑製率顯著上升,細胞週期顯著阻滯在G1期,且細胞凋亡率極顯著升高.結論 pIRES-p16ink4a-hRb1雙順反子穿梭載體的構建與真覈細胞導入、目的基因錶達成功,為進一步研究p16ink4a與hRb1相互關繫在細胞週期調控中的作用奠定瞭基礎.
목적응용내부핵당체삽입위점(IRES)서렬구건단계동자쌍순반자천사재체pIRES-p16ink4a-hRb1병감정,관찰기도입골육류세포후대세포주기적조공.방법이용기인공정기술,장p16ink4a여hRb1전장cDNA편마구의차아극륭지pIRES재체중,질립구건통과PCR、쌍매절여측서감정;지질체전염지p16ink4a표체결실、hRb1표체양성적골육류세포주MG63,G418사선획득항성극륭,통과RT-PCR화Western blot법분석외원기인표체;류식세포술분석세포주기특이성화세포조망솔,사갑기우담서람(MTT)비색법여세포생장곡선관찰세포증식정황.결과성공구건출pIRES-p16ink4a-hRb1재체,외원기인재파세포mRNA화단백수평분별유독립표체.여대조조비교,쌍기인도입조세포생장억제솔현저상승,세포주기현저조체재G1기,차세포조망솔겁현저승고.결론 pIRES-p16ink4a-hRb1쌍순반자천사재체적구건여진핵세포도입、목적기인표체성공,위진일보연구p16ink4a여hRb1상호관계재세포주기조공중적작용전정료기출.
