中国组织工程研究与临床康复
中國組織工程研究與臨床康複
중국조직공정연구여림상강복
JOURNAL OF CLINICAL REHABILITATIVE TISSUE ENGINEERING RESEARCH
2007年
27期
5303-5306
,共4页
KDR%RNA干扰%定量PCR%细胞增殖
KDR%RNA榦擾%定量PCR%細胞增殖
KDR%RNA간우%정량PCR%세포증식
目的:应用RNA干扰技术设计构建针对血管内皮细胞生长因子受体KDR的小干扰RNA,并观察脂质体转染肺癌细胞A549后的干扰效果.方法:实验于2005-03/2006-01在沈阳医学院生物化学及分子生物学教研室完成.①设计针对KDR编码区有短发夹结构的3条mRNA序列,经退火成互补双链,克隆到pGCsi.H1/neo/GFP载体中构建3个重组质粒,分别命名为KDR-siRNA1、KDR-siRNA2和KDR-siRNA3.②设立5组:小干扰RNA组,分别转染KDR-siRNA1、KDR-siRNA2和KDR-siRNA3;阳性对照组,转染pGCsi.H1/neo/siGFP,该质粒载体中的插入序列为针对绿色荧光蛋白的小干扰RNA,不干扰待研究的内源性基因;阴性对照组,转染pGCsi.H1/neo/GFP/NON,该载体为不干扰任何内源性基因的小干扰RNA;空白对照组,转染pGCsi.H1/neo/GFP空载体;正常对照组,不进行任何转染.③对重组质粒进行酶切鉴定、DNA测序分析;脂质体法转染质粒至肺癌A549细胞株后,实时定量PCR检测KDR mRNA的水平变化;细胞计数法绘制细胞生长曲线.结果:①小干扰RNA表达载体的鉴定:KDR-siRNA1、KDR-siRNA2和KDR-siRNA3表达载体用限制性内切酶NdeⅠ和SmaⅠ进行单酶切后,均产生约713 bp、5 480 bp和2 403 bp、3 790 bp两个片段,与预期结果相同.测序结果与设计的编码相应短发夹状KDR-小干扰RNA的寡核苷酸序列一致,证明KDR-小干扰RNA真核表达载体构建成功.②KDR-小干扰RNA对A549细胞中KDR mRNA水平的影响:与阳性对照组、阴性对照组、空白对照组和正常对照组的A549细胞相比,KDR-siRNA1,2,3表达载体转染后的A549细胞KDR基因表达水平均明显受到抑制,抑制率分别为64%、81%和72%,其中以KDR-siRNA2抑制作用最为明显.③KDR-小干扰RNA对A549细胞生长的影响:阳性对照组、阴性对照组、空白对照组、正常对照组的A549细胞生长趋势较为一致,且生长速度均明显高于转染3种KDR-小干扰RNA表达载体的A549细胞,从接种第2天开始差异有显著性意义(t=15.29～17.65,P均＜0.01).结论:血管内皮细胞生长因子受体KDR靶向RNA干扰重组质粒构建成功,该载体能有效抑制肺癌A549细胞KDR基因表达与细胞增殖.
目的:應用RNA榦擾技術設計構建針對血管內皮細胞生長因子受體KDR的小榦擾RNA,併觀察脂質體轉染肺癌細胞A549後的榦擾效果.方法:實驗于2005-03/2006-01在瀋暘醫學院生物化學及分子生物學教研室完成.①設計針對KDR編碼區有短髮夾結構的3條mRNA序列,經退火成互補雙鏈,剋隆到pGCsi.H1/neo/GFP載體中構建3箇重組質粒,分彆命名為KDR-siRNA1、KDR-siRNA2和KDR-siRNA3.②設立5組:小榦擾RNA組,分彆轉染KDR-siRNA1、KDR-siRNA2和KDR-siRNA3;暘性對照組,轉染pGCsi.H1/neo/siGFP,該質粒載體中的插入序列為針對綠色熒光蛋白的小榦擾RNA,不榦擾待研究的內源性基因;陰性對照組,轉染pGCsi.H1/neo/GFP/NON,該載體為不榦擾任何內源性基因的小榦擾RNA;空白對照組,轉染pGCsi.H1/neo/GFP空載體;正常對照組,不進行任何轉染.③對重組質粒進行酶切鑒定、DNA測序分析;脂質體法轉染質粒至肺癌A549細胞株後,實時定量PCR檢測KDR mRNA的水平變化;細胞計數法繪製細胞生長麯線.結果:①小榦擾RNA錶達載體的鑒定:KDR-siRNA1、KDR-siRNA2和KDR-siRNA3錶達載體用限製性內切酶NdeⅠ和SmaⅠ進行單酶切後,均產生約713 bp、5 480 bp和2 403 bp、3 790 bp兩箇片段,與預期結果相同.測序結果與設計的編碼相應短髮夾狀KDR-小榦擾RNA的寡覈苷痠序列一緻,證明KDR-小榦擾RNA真覈錶達載體構建成功.②KDR-小榦擾RNA對A549細胞中KDR mRNA水平的影響:與暘性對照組、陰性對照組、空白對照組和正常對照組的A549細胞相比,KDR-siRNA1,2,3錶達載體轉染後的A549細胞KDR基因錶達水平均明顯受到抑製,抑製率分彆為64%、81%和72%,其中以KDR-siRNA2抑製作用最為明顯.③KDR-小榦擾RNA對A549細胞生長的影響:暘性對照組、陰性對照組、空白對照組、正常對照組的A549細胞生長趨勢較為一緻,且生長速度均明顯高于轉染3種KDR-小榦擾RNA錶達載體的A549細胞,從接種第2天開始差異有顯著性意義(t=15.29～17.65,P均＜0.01).結論:血管內皮細胞生長因子受體KDR靶嚮RNA榦擾重組質粒構建成功,該載體能有效抑製肺癌A549細胞KDR基因錶達與細胞增殖.
목적:응용RNA간우기술설계구건침대혈관내피세포생장인자수체KDR적소간우RNA,병관찰지질체전염폐암세포A549후적간우효과.방법:실험우2005-03/2006-01재침양의학원생물화학급분자생물학교연실완성.①설계침대KDR편마구유단발협결구적3조mRNA서렬,경퇴화성호보쌍련,극륭도pGCsi.H1/neo/GFP재체중구건3개중조질립,분별명명위KDR-siRNA1、KDR-siRNA2화KDR-siRNA3.②설립5조:소간우RNA조,분별전염KDR-siRNA1、KDR-siRNA2화KDR-siRNA3;양성대조조,전염pGCsi.H1/neo/siGFP,해질립재체중적삽입서렬위침대록색형광단백적소간우RNA,불간우대연구적내원성기인;음성대조조,전염pGCsi.H1/neo/GFP/NON,해재체위불간우임하내원성기인적소간우RNA;공백대조조,전염pGCsi.H1/neo/GFP공재체;정상대조조,불진행임하전염.③대중조질립진행매절감정、DNA측서분석;지질체법전염질립지폐암A549세포주후,실시정량PCR검측KDR mRNA적수평변화;세포계수법회제세포생장곡선.결과:①소간우RNA표체재체적감정:KDR-siRNA1、KDR-siRNA2화KDR-siRNA3표체재체용한제성내절매NdeⅠ화SmaⅠ진행단매절후,균산생약713 bp、5 480 bp화2 403 bp、3 790 bp량개편단,여예기결과상동.측서결과여설계적편마상응단발협상KDR-소간우RNA적과핵감산서렬일치,증명KDR-소간우RNA진핵표체재체구건성공.②KDR-소간우RNA대A549세포중KDR mRNA수평적영향:여양성대조조、음성대조조、공백대조조화정상대조조적A549세포상비,KDR-siRNA1,2,3표체재체전염후적A549세포KDR기인표체수평균명현수도억제,억제솔분별위64%、81%화72%,기중이KDR-siRNA2억제작용최위명현.③KDR-소간우RNA대A549세포생장적영향:양성대조조、음성대조조、공백대조조、정상대조조적A549세포생장추세교위일치,차생장속도균명현고우전염3충KDR-소간우RNA표체재체적A549세포,종접충제2천개시차이유현저성의의(t=15.29～17.65,P균＜0.01).결론:혈관내피세포생장인자수체KDR파향RNA간우중조질립구건성공,해재체능유효억제폐암A549세포KDR기인표체여세포증식.
