华中科技大学学报（医学版）
華中科技大學學報（醫學版）
화중과기대학학보（의학판）
ACTA UNIVERSITATIS MEDICINAE TONGJI
2008年
1期
1-4
,共4页
闫媛%章杰%杨渝珍%过健俐%李禹琼
閆媛%章傑%楊渝珍%過健俐%李禹瓊
염원%장걸%양투진%과건리%리우경
人肿瘤坏死因子前体水解酶%解整合素%真核表达载体%重叠延伸PCR%转染
人腫瘤壞死因子前體水解酶%解整閤素%真覈錶達載體%重疊延伸PCR%轉染
인종류배사인자전체수해매%해정합소%진핵표체재체%중첩연신PCR%전염
目的 构建人肿瘤坏死因子前体水解酶(TACE)系列真核表达载体,转染HeLa细胞,建立稳定转染的HeLa细胞系.方法 以THPl细胞eDNA为模板,PCR扩增人TACE基因的全长eDNA编码区序列,将其插入pMD18T载体中,构建出pMD18T-FL-TACE载体.在此基础上,应用重叠延伸PCR扩增出缺失解整合素区的TACE重组cDNA和缺失酶区的TACE重组cDNA,利用DNA重组技术将其分别定向插入真核表达载体plRES2.0-EGFP中,同时TACE全长也构建入pIRES2.0-EGFP,这3种真核表达载体经酶切和测序鉴定后,用脂质体法转染HeLa细胞,经过G418筛选,获得稳定转染的HeLa细胞株,采用RT-PCR、Western blot及荧光法检测表达.结果 成功构建了pIRES2.0-EG-FP/FL-TACE、plRES2.0-EGFP/dis△-TACE、plRES2.0-EGFP/met△-TACE真核表达载体,并建立了稳定转染的HeLa细胞株,成功地表达了目的基因.结论 真核表达载体的构建和稳定转染HeLa细胞株的建立为进一步研究TACE功能奠定了必要的实验基础.
目的 構建人腫瘤壞死因子前體水解酶(TACE)繫列真覈錶達載體,轉染HeLa細胞,建立穩定轉染的HeLa細胞繫.方法 以THPl細胞eDNA為模闆,PCR擴增人TACE基因的全長eDNA編碼區序列,將其插入pMD18T載體中,構建齣pMD18T-FL-TACE載體.在此基礎上,應用重疊延伸PCR擴增齣缺失解整閤素區的TACE重組cDNA和缺失酶區的TACE重組cDNA,利用DNA重組技術將其分彆定嚮插入真覈錶達載體plRES2.0-EGFP中,同時TACE全長也構建入pIRES2.0-EGFP,這3種真覈錶達載體經酶切和測序鑒定後,用脂質體法轉染HeLa細胞,經過G418篩選,穫得穩定轉染的HeLa細胞株,採用RT-PCR、Western blot及熒光法檢測錶達.結果 成功構建瞭pIRES2.0-EG-FP/FL-TACE、plRES2.0-EGFP/dis△-TACE、plRES2.0-EGFP/met△-TACE真覈錶達載體,併建立瞭穩定轉染的HeLa細胞株,成功地錶達瞭目的基因.結論 真覈錶達載體的構建和穩定轉染HeLa細胞株的建立為進一步研究TACE功能奠定瞭必要的實驗基礎.
목적 구건인종류배사인자전체수해매(TACE)계렬진핵표체재체,전염HeLa세포,건립은정전염적HeLa세포계.방법 이THPl세포eDNA위모판,PCR확증인TACE기인적전장eDNA편마구서렬,장기삽입pMD18T재체중,구건출pMD18T-FL-TACE재체.재차기출상,응용중첩연신PCR확증출결실해정합소구적TACE중조cDNA화결실매구적TACE중조cDNA,이용DNA중조기술장기분별정향삽입진핵표체재체plRES2.0-EGFP중,동시TACE전장야구건입pIRES2.0-EGFP,저3충진핵표체재체경매절화측서감정후,용지질체법전염HeLa세포,경과G418사선,획득은정전염적HeLa세포주,채용RT-PCR、Western blot급형광법검측표체.결과 성공구건료pIRES2.0-EG-FP/FL-TACE、plRES2.0-EGFP/dis△-TACE、plRES2.0-EGFP/met△-TACE진핵표체재체,병건립료은정전염적HeLa세포주,성공지표체료목적기인.결론 진핵표체재체적구건화은정전염HeLa세포주적건립위진일보연구TACE공능전정료필요적실험기출.
