实验动物与比较医学
實驗動物與比較醫學
실험동물여비교의학
LABORATORY ANIMAL AND COMPARATIVE MEDICINE
2010年
4期
233-240
,共8页
王伟%张传山%郭毅%谷瑞环%丁雷%姚刚%陈学进
王偉%張傳山%郭毅%穀瑞環%丁雷%姚剛%陳學進
왕위%장전산%곽의%곡서배%정뢰%요강%진학진
基因敲除%兔成纤维体细胞%次黄嘌吟-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶%细胞筛选
基因敲除%兔成纖維體細胞%次黃嘌吟-鳥嘌呤燐痠覈糖轉移酶%細胞篩選
기인고제%토성섬유체세포%차황표음-조표령린산핵당전이매%세포사선
目的 构建兔HPRT基因打靶载体.方法 在已经筛选到含有兔全长次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase,HGPRT)基因BAC克隆(LBNL1304M19)的基础上,利用Red重组系统,从此克隆上将一段12.5 kb无启动子的HGPRT基因组片段克隆到pKS-质粒上,产生pKS-HGPRT质粒.然后基于pKS-HGPRT和pEGFP-C1-SD1211质粒,构建了含有绿色荧光蛋白(GFP)及新霉素(neo)筛选标记基因的打靶载体pKS-HGPRT-neo.结果 将线性化的打靶载体通过脂质体转染的方法整合到成体兔成纤维细胞基因组中,利用G418及6-TG进行细胞克隆的抗药物筛选,共得到抗性细胞克隆20个.对细胞克隆进行PCR及测序初步鉴定,获得8个发生同源重组的细胞克隆,还需利用Southern blotting做进一步验证.结论 成功快速地构建了HPRT基因敲除型打靶载体,为下一步进行体细胞核移植制备HGPRT基因敲除转基因克隆兔奠定基础.
目的 構建兔HPRT基因打靶載體.方法 在已經篩選到含有兔全長次黃嘌呤-鳥嘌呤燐痠覈糖轉移酶(Hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase,HGPRT)基因BAC剋隆(LBNL1304M19)的基礎上,利用Red重組繫統,從此剋隆上將一段12.5 kb無啟動子的HGPRT基因組片段剋隆到pKS-質粒上,產生pKS-HGPRT質粒.然後基于pKS-HGPRT和pEGFP-C1-SD1211質粒,構建瞭含有綠色熒光蛋白(GFP)及新黴素(neo)篩選標記基因的打靶載體pKS-HGPRT-neo.結果 將線性化的打靶載體通過脂質體轉染的方法整閤到成體兔成纖維細胞基因組中,利用G418及6-TG進行細胞剋隆的抗藥物篩選,共得到抗性細胞剋隆20箇.對細胞剋隆進行PCR及測序初步鑒定,穫得8箇髮生同源重組的細胞剋隆,還需利用Southern blotting做進一步驗證.結論 成功快速地構建瞭HPRT基因敲除型打靶載體,為下一步進行體細胞覈移植製備HGPRT基因敲除轉基因剋隆兔奠定基礎.
목적 구건토HPRT기인타파재체.방법 재이경사선도함유토전장차황표령-조표령린산핵당전이매(Hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase,HGPRT)기인BAC극륭(LBNL1304M19)적기출상,이용Red중조계통,종차극륭상장일단12.5 kb무계동자적HGPRT기인조편단극륭도pKS-질립상,산생pKS-HGPRT질립.연후기우pKS-HGPRT화pEGFP-C1-SD1211질립,구건료함유록색형광단백(GFP)급신매소(neo)사선표기기인적타파재체pKS-HGPRT-neo.결과 장선성화적타파재체통과지질체전염적방법정합도성체토성섬유세포기인조중,이용G418급6-TG진행세포극륭적항약물사선,공득도항성세포극륭20개.대세포극륭진행PCR급측서초보감정,획득8개발생동원중조적세포극륭,환수이용Southern blotting주진일보험증.결론 성공쾌속지구건료HPRT기인고제형타파재체,위하일보진행체세포핵이식제비HGPRT기인고제전기인극륭토전정기출.
