生物技术通讯
生物技術通訊
생물기술통신
LETTERS IN BIOTECHNOLOGY
2012年
4期
537-541
,共5页
徐洁森%魏建和%赵立子%隋春%徐艳红
徐潔森%魏建和%趙立子%隋春%徐豔紅
서길삼%위건화%조립자%수춘%서염홍
北柴胡%细胞色素P450酶%基因克隆%植物表达载体
北柴鬍%細胞色素P450酶%基因剋隆%植物錶達載體
북시호%세포색소P450매%기인극륭%식물표체재체
目的:克隆北柴胡中可能参与柴胡皂苷生物合成的细胞色素P450酶基因,构建其过量表达载体,为通过转基因验证其功能奠定基础.方法:在454高通量测序获得5'和3'端部分cDNA序列的基础上,利用LD-PCR方法获得全长cDNA,根据全长cDNA序列设计含有酶切位点的PCR引物,利用高保真酶,以RNA反转录产物为模板PCR扩增细胞色素P450酶基因的开放读框,扩增产物与pEASY-T1 Simple载体连接,转化大肠杆菌DH5α;重组质粒pT1-P450经菌液PCR和酶切方法验证后测序,采用NCBI在线Blastx、DNAman和MEGA4软件对序列进行生物信息学分析,随后将pT1-P450的酶切产物插入双元载体pCAMBIA-SUPER 1300,菌液PCR和酶切验证重组质粒p1300-P450.结果:扩增到了北柴胡细胞色素P450酶基因BcCYP87E,构建了这一基因的过量表达载体.结论:细胞色素P450酶基因的克隆和转基因载体的构建,为后续开展转基因研究,验证其生物功能奠定了基础.
目的:剋隆北柴鬍中可能參與柴鬍皂苷生物閤成的細胞色素P450酶基因,構建其過量錶達載體,為通過轉基因驗證其功能奠定基礎.方法:在454高通量測序穫得5'和3'耑部分cDNA序列的基礎上,利用LD-PCR方法穫得全長cDNA,根據全長cDNA序列設計含有酶切位點的PCR引物,利用高保真酶,以RNA反轉錄產物為模闆PCR擴增細胞色素P450酶基因的開放讀框,擴增產物與pEASY-T1 Simple載體連接,轉化大腸桿菌DH5α;重組質粒pT1-P450經菌液PCR和酶切方法驗證後測序,採用NCBI在線Blastx、DNAman和MEGA4軟件對序列進行生物信息學分析,隨後將pT1-P450的酶切產物插入雙元載體pCAMBIA-SUPER 1300,菌液PCR和酶切驗證重組質粒p1300-P450.結果:擴增到瞭北柴鬍細胞色素P450酶基因BcCYP87E,構建瞭這一基因的過量錶達載體.結論:細胞色素P450酶基因的剋隆和轉基因載體的構建,為後續開展轉基因研究,驗證其生物功能奠定瞭基礎.
목적:극륭북시호중가능삼여시호조감생물합성적세포색소P450매기인,구건기과량표체재체,위통과전기인험증기공능전정기출.방법:재454고통량측서획득5'화3'단부분cDNA서렬적기출상,이용LD-PCR방법획득전장cDNA,근거전장cDNA서렬설계함유매절위점적PCR인물,이용고보진매,이RNA반전록산물위모판PCR확증세포색소P450매기인적개방독광,확증산물여pEASY-T1 Simple재체련접,전화대장간균DH5α;중조질립pT1-P450경균액PCR화매절방법험증후측서,채용NCBI재선Blastx、DNAman화MEGA4연건대서렬진행생물신식학분석,수후장pT1-P450적매절산물삽입쌍원재체pCAMBIA-SUPER 1300,균액PCR화매절험증중조질립p1300-P450.결과:확증도료북시호세포색소P450매기인BcCYP87E,구건료저일기인적과량표체재체.결론:세포색소P450매기인적극륭화전기인재체적구건,위후속개전전기인연구,험증기생물공능전정료기출.
