医学分子生物学杂志
醫學分子生物學雜誌
의학분자생물학잡지
FOREIGN MEDICAL SCIENCES
2010年
3期
206-210
,共5页
王娟%关洪斌%闫月敏%石秉炀%杨奔%薛征%董文吉
王娟%關洪斌%閆月敏%石秉煬%楊奔%薛徵%董文吉
왕연%관홍빈%염월민%석병양%양분%설정%동문길
核基质结合蛋白SATB1%蛋白激酶AKT2%体外液酶活性分析
覈基質結閤蛋白SATB1%蛋白激酶AKT2%體外液酶活性分析
핵기질결합단백SATB1%단백격매AKT2%체외액매활성분석
目的 建立蛋白激酶AKT2体外磷酸化检测体系.方法 构建携带AKT2 cDNA编码区的pLNCX2逆转录病毒重组载体,包装重组病毒,转导293A细胞,G418筛选得到稳定表达组成型活化的AKT2细胞株,应用免疫沉淀获得蛋白激AKT2;将核基质结合蛋白SATB1的1～204的氨基酸序列及其47位丝氨酸的突变体S47A、S47D,分别与GST基因融合表达载体pGEX4T-1进行重组,经测序鉴定后转化大肠埃希菌BL-21,IPTG诱导表达经亲和纯化得到GST-SATB1 1-204、GST-SATB1 1-204 S47A和GST-SATB1 1-204 S47D融合蛋白;利用免疫沉淀的AKT2磷酸化GST-SATB1融合蛋白,应用免疫印迹检测其是否被磷酸化.结果 细胞表达的蛋白激酶AKT2能高效的将野生型SATB1 1-204 磷酸化,而不能磷酸化其两种突变体.结论 成功建立了一个蛋白激酶体外磷酸化系统.
目的 建立蛋白激酶AKT2體外燐痠化檢測體繫.方法 構建攜帶AKT2 cDNA編碼區的pLNCX2逆轉錄病毒重組載體,包裝重組病毒,轉導293A細胞,G418篩選得到穩定錶達組成型活化的AKT2細胞株,應用免疫沉澱穫得蛋白激AKT2;將覈基質結閤蛋白SATB1的1～204的氨基痠序列及其47位絲氨痠的突變體S47A、S47D,分彆與GST基因融閤錶達載體pGEX4T-1進行重組,經測序鑒定後轉化大腸埃希菌BL-21,IPTG誘導錶達經親和純化得到GST-SATB1 1-204、GST-SATB1 1-204 S47A和GST-SATB1 1-204 S47D融閤蛋白;利用免疫沉澱的AKT2燐痠化GST-SATB1融閤蛋白,應用免疫印跡檢測其是否被燐痠化.結果 細胞錶達的蛋白激酶AKT2能高效的將野生型SATB1 1-204 燐痠化,而不能燐痠化其兩種突變體.結論 成功建立瞭一箇蛋白激酶體外燐痠化繫統.
목적 건립단백격매AKT2체외린산화검측체계.방법 구건휴대AKT2 cDNA편마구적pLNCX2역전록병독중조재체,포장중조병독,전도293A세포,G418사선득도은정표체조성형활화적AKT2세포주,응용면역침정획득단백격AKT2;장핵기질결합단백SATB1적1～204적안기산서렬급기47위사안산적돌변체S47A、S47D,분별여GST기인융합표체재체pGEX4T-1진행중조,경측서감정후전화대장애희균BL-21,IPTG유도표체경친화순화득도GST-SATB1 1-204、GST-SATB1 1-204 S47A화GST-SATB1 1-204 S47D융합단백;이용면역침정적AKT2린산화GST-SATB1융합단백,응용면역인적검측기시부피린산화.결과 세포표체적단백격매AKT2능고효적장야생형SATB1 1-204 린산화,이불능린산화기량충돌변체.결론 성공건립료일개단백격매체외린산화계통.
