CAJ | 학술논문

目的:通过用5-溴脱氧尿苷(5- bromodeoxyuridine,BrdU)标记胎兔骨髓间充质干细胞(bone marrow rnesenchymal stem cells,BMSCs),探讨BrdU作为干细胞标记示踪方法的可行性.方法:取胎兔骨髓组织密度梯度离心法分离培养BMSCs.取P3代细胞以终浓度分别为5,10,15,20 mg/L的BrdU进行标记,分别记为A,B,C,D组；另1孔不含BrdU,作为空白对照(E组).标记12,24,48,72 h后,采用免疫组织化学检测各组细胞阳性率,苔盼蓝排染法细胞计数观察标记后细胞活性.结果:细胞培养观察:原代培养的细胞形态主要为宽大扁平短梭形细胞；传代后细胞形态为长梭形；第3代BMSCs经诱导均能向成骨细胞和脂肪细胞分化.免疫组织化学观察:第3代BMSCs经BrdU标记后,在荧光显微镜下胞核呈绿色荧光.孵育12 h,A,B,C,D组细胞标记阳性率逐渐增高,分别为(33.2±4.3)%、(34.5±3.9)%、(47.9±4.8)%、(52.8±5.1)%,对照组细胞标记阳性率为0,C,D组与A组比较,差异有统计学意义(P＜0.01);24 h,A,B,C,D组标记率分别为(48.1±4.0)%、(83.4±5.3)%、(91.7±4.9)%、(92.6±4.2)%,对照组细胞标记阳性率为0.48 h和72 h,A,B,C,D,E组标记情况与24 h相似.孵育24,48,72 h,10,15,20mg/L组细胞阳性率与5 mg/L组比较,差异有统计学意义(P＜0.01).细胞计数:孵育12h,各组细胞活性均在90%以上,A、B、C、D组与对照组(E)比较,差异无统计学意义(P＞0.05)；孵育24,48,72 h,各组细胞活性情况与12h情况相似,A,B,C,D组与对照组(E)比较,差异无统计学意义(P＞0.05).随着标记时间的延长和BrdU剂量的增加,标记率逐渐增高,BrdU终浓度为10 mg/L以上,且标记48 h后细胞标记率＞90%,活细胞数＞90%.结论:BrdU标记BMSCs的最佳时间为48 h,最佳浓度为10 mg/L;BrdU对细胞毒性小,标记率及安全性高.
목적:통과용5-추탈양뇨감(5- bromodeoxyuridine,BrdU)표기태토골수간충질간세포(bone marrow rnesenchymal stem cells,BMSCs),탐토BrdU작위간세포표기시종방법적가행성.방법:취태토골수조직밀도제도리심법분리배양BMSCs.취P3대세포이종농도분별위5,10,15,20 mg/L적BrdU진행표기,분별기위A,B,C,D조；령1공불함BrdU,작위공백대조(E조).표기12,24,48,72 h후,채용면역조직화학검측각조세포양성솔,태반람배염법세포계수관찰표기후세포활성.결과:세포배양관찰:원대배양적세포형태주요위관대편평단사형세포；전대후세포형태위장사형；제3대BMSCs경유도균능향성골세포화지방세포분화.면역조직화학관찰:제3대BMSCs경BrdU표기후,재형광현미경하포핵정록색형광.부육12 h,A,B,C,D조세포표기양성솔축점증고,분별위(33.2±4.3)%、(34.5±3.9)%、(47.9±4.8)%、(52.8±5.1)%,대조조세포표기양성솔위0,C,D조여A조비교,차이유통계학의의(P＜0.01);24 h,A,B,C,D조표기솔분별위(48.1±4.0)%、(83.4±5.3)%、(91.7±4.9)%、(92.6±4.2)%,대조조세포표기양성솔위0.48 h화72 h,A,B,C,D,E조표기정황여24 h상사.부육24,48,72 h,10,15,20mg/L조세포양성솔여5 mg/L조비교,차이유통계학의의(P＜0.01).세포계수:부육12h,각조세포활성균재90%이상,A、B、C、D조여대조조(E)비교,차이무통계학의의(P＞0.05)；부육24,48,72 h,각조세포활성정황여12h정황상사,A,B,C,D조여대조조(E)비교,차이무통계학의의(P＞0.05).수착표기시간적연장화BrdU제량적증가,표기솔축점증고,BrdU종농도위10 mg/L이상,차표기48 h후세포표기솔＞90%,활세포수＞90%.결론:BrdU표기BMSCs적최가시간위48 h,최가농도위10 mg/L;BrdU대세포독성소,표기솔급안전성고.