CAJ | 학술논문

目的:建立稳定表达乳腺癌耐药蛋白(Breast cancer resistance protein,BCRP)的小鼠成纤维细胞系PA317/BCRP,初步探讨其耐药机制.方法:从乳腺癌耐药细胞系MCF-7/ADR中克隆BCRP基因.将编码序列克隆导入真核表达载体pcDNA3.1,转化感受态E.Coli DH5α,获得重组质粒pcDNA3.1/BCRP,酶切并测序鉴定.用电穿孔法将质粒转染PA317细胞,同时转染pcDNA3.1/EGFP.G418筛选阳性克隆.阳性转染细胞提取细胞总RNA,RT-PCR检测BCRP的mRNA表达.Western blot检测BCRP蛋白表达.MTT法检测耐药克隆PA317/BCRP细胞对米托蒽醌(Mitoxantrone,MTZ)耐药性,罗丹明123外排实验验证转染后细胞外排罗丹明123功能.Western blot检测P13K-AKT信号转导通路下游靶点AKT表达变化.结果:构建质粒pcDNA3.1/BCRP,转染PA317细胞,G418筛选.RT-PCR和Westem blot,均检测到细胞中BCRP基因转录及蛋白表达.与空质粒转染细胞、未转染细胞时照组相比,PA317/BCRP细胞对MTZ耐药性增强,且外排罗丹明123能力增强.检测P13K-AKT途径下游靶点AKT蛋白磷酸化水平在PA317/BCRP细胞内明显增高.结论:1、成功获得稳定表达BCRP的PA317细胞系-PA317/BCRP,经MTT和罗丹明123外排实验证实,其耐药和外排功能增强.2、检测PA317/BCRP细胞P13K-AKT途径下游靶点AKT的表达,观察到耐药细胞的AKT表达含量明显高于转染空质粒和未转染的PA317细胞.推测BCRP可能通过影响AKT表达上调发挥其耐药作用.
목적:건립은정표체유선암내약단백(Breast cancer resistance protein,BCRP)적소서성섬유세포계PA317/BCRP,초보탐토기내약궤제.방법:종유선암내약세포계MCF-7/ADR중극륭BCRP기인.장편마서렬극륭도입진핵표체재체pcDNA3.1,전화감수태E.Coli DH5α,획득중조질립pcDNA3.1/BCRP,매절병측서감정.용전천공법장질립전염PA317세포,동시전염pcDNA3.1/EGFP.G418사선양성극륭.양성전염세포제취세포총RNA,RT-PCR검측BCRP적mRNA표체.Western blot검측BCRP단백표체.MTT법검측내약극륭PA317/BCRP세포대미탁은곤(Mitoxantrone,MTZ)내약성,라단명123외배실험험증전염후세포외배라단명123공능.Western blot검측P13K-AKT신호전도통로하유파점AKT표체변화.결과:구건질립pcDNA3.1/BCRP,전염PA317세포,G418사선.RT-PCR화Westem blot,균검측도세포중BCRP기인전록급단백표체.여공질립전염세포、미전염세포시조조상비,PA317/BCRP세포대MTZ내약성증강,차외배라단명123능력증강.검측P13K-AKT도경하유파점AKT단백린산화수평재PA317/BCRP세포내명현증고.결론:1、성공획득은정표체BCRP적PA317세포계-PA317/BCRP,경MTT화라단명123외배실험증실,기내약화외배공능증강.2、검측PA317/BCRP세포P13K-AKT도경하유파점AKT적표체,관찰도내약세포적AKT표체함량명현고우전염공질립화미전염적PA317세포.추측BCRP가능통과영향AKT표체상조발휘기내약작용.