中华显微外科杂志
中華顯微外科雜誌
중화현미외과잡지
Chinese Journal of Microsurgery
2011年
3期
217-220,封3
,共5页
徐绘华%郭奇峰%厉新妍%刘青华%向帅%娄盼
徐繪華%郭奇峰%厲新妍%劉青華%嚮帥%婁盼
서회화%곽기봉%려신연%류청화%향수%루반
骨形态发生蛋白-2%碱性成纤维细胞生长因子%双基因共表达%T2A序列%腺病毒
骨形態髮生蛋白-2%堿性成纖維細胞生長因子%雙基因共錶達%T2A序列%腺病毒
골형태발생단백-2%감성성섬유세포생장인자%쌍기인공표체%T2A서렬%선병독
目的 探讨用一条Link序列T2A连接骨形态发生蛋白-2(BMP-2)基因与碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)基因构建含目的 基因的腺病毒载体的可行性.方法 先从cDNA中扩增得到全长BMP-2和bFGF基因片段,再接于Link序列T2A的两端.通过T2A Peptide的互补.延伸得到BMP2-T2A-bFGF的全长PCR产物,利用上游引物的Bgl Ⅱ酶切位点和下游引物的EeoRV酶切位点将其插入到pShuttle-IRES载体中,酶切、测序鉴定;利用同源重组技术将目的 基因表达框从穿梭质粒转移到腺病毒载体,鉴定阳性克隆;将PacI线性化后的腺病毒载体转染到293A细胞,观察GFP表达,PCR鉴定后进行大量扩增,并用CsCl梯度离心法进行纯化;测量A260,计算病毒感染滴度.结果 克隆得到的BMP-2与bFGF基因测序正确.经BglⅡ和EeoR Ⅴ双酶切得到的BMP2-bFGF 2个基因全长序列完全克隆到穿梭质粒和重组腺病毒载体质粒中;转染293A细胞2周后观察到明显的GFP聚集表达,即病毒包装成功,扩增纯化后滴度为3.6×1011 VP/ml.结论 经酶切鉴定BMP-2与bFGF双基因共表达腺病毒载体构建成功.
目的 探討用一條Link序列T2A連接骨形態髮生蛋白-2(BMP-2)基因與堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)基因構建含目的 基因的腺病毒載體的可行性.方法 先從cDNA中擴增得到全長BMP-2和bFGF基因片段,再接于Link序列T2A的兩耑.通過T2A Peptide的互補.延伸得到BMP2-T2A-bFGF的全長PCR產物,利用上遊引物的Bgl Ⅱ酶切位點和下遊引物的EeoRV酶切位點將其插入到pShuttle-IRES載體中,酶切、測序鑒定;利用同源重組技術將目的 基因錶達框從穿梭質粒轉移到腺病毒載體,鑒定暘性剋隆;將PacI線性化後的腺病毒載體轉染到293A細胞,觀察GFP錶達,PCR鑒定後進行大量擴增,併用CsCl梯度離心法進行純化;測量A260,計算病毒感染滴度.結果 剋隆得到的BMP-2與bFGF基因測序正確.經BglⅡ和EeoR Ⅴ雙酶切得到的BMP2-bFGF 2箇基因全長序列完全剋隆到穿梭質粒和重組腺病毒載體質粒中;轉染293A細胞2週後觀察到明顯的GFP聚集錶達,即病毒包裝成功,擴增純化後滴度為3.6×1011 VP/ml.結論 經酶切鑒定BMP-2與bFGF雙基因共錶達腺病毒載體構建成功.
목적 탐토용일조Link서렬T2A련접골형태발생단백-2(BMP-2)기인여감성성섬유세포생장인자(bFGF)기인구건함목적 기인적선병독재체적가행성.방법 선종cDNA중확증득도전장BMP-2화bFGF기인편단,재접우Link서렬T2A적량단.통과T2A Peptide적호보.연신득도BMP2-T2A-bFGF적전장PCR산물,이용상유인물적Bgl Ⅱ매절위점화하유인물적EeoRV매절위점장기삽입도pShuttle-IRES재체중,매절、측서감정;이용동원중조기술장목적 기인표체광종천사질립전이도선병독재체,감정양성극륭;장PacI선성화후적선병독재체전염도293A세포,관찰GFP표체,PCR감정후진행대량확증,병용CsCl제도리심법진행순화;측량A260,계산병독감염적도.결과 극륭득도적BMP-2여bFGF기인측서정학.경BglⅡ화EeoR Ⅴ쌍매절득도적BMP2-bFGF 2개기인전장서렬완전극륭도천사질립화중조선병독재체질립중;전염293A세포2주후관찰도명현적GFP취집표체,즉병독포장성공,확증순화후적도위3.6×1011 VP/ml.결론 경매절감정BMP-2여bFGF쌍기인공표체선병독재체구건성공.
