CAJ | 학술논문

为获得人4IgB7-H3-Fc融合蛋白,研究其对T细胞的共刺激作用,采用PCR技术分别从pMD18-T/4IgB7-H3和pMD18-T/hIgG1(Fc)重组载体中扩增出人4IgB7-H3胞外段基因和人IgG1 重链Fc恒定区基因,通过RT-PCR技术插入逆转录病毒载体pGEZ-Term,重组逆转录病毒载体与两个辅助病毒载体经脂质体法共转染包装细胞293T,收集含有完整病毒颗粒的293T细胞的培养上清反复感染L929 细胞,利用Zeocin 筛选获得能稳定分泌4IgB7-H3-Fc融合蛋白的基因转染细胞.基因转染细胞经无血清培养后,收集的上清用Dot blot检测,超滤浓缩并经Protein G柱纯化,再用SDS-PAGE、Western blot 鉴定.以4IgB7-H3-Fc蛋白检测活化T细胞表面未知受体的表达,通过MTT方法分析4IgB7-H3-Fc融合蛋白对T细胞的共刺激作用.结果显示,成功地构建了pEGZ-Term/4IgB7-H3-Fc重组逆转录病毒载体,经转染包装细胞293T 后,筛选获得能稳定分泌4IgB7-H3-Fc蛋白的L929基因转染细胞株;纯化后的4IgB7-H3-Fc蛋白能够与活化T细胞表面结合,并对T细胞有显著的促增殖作用.为探讨人4IgB7-H3-Fc融合蛋白对T细胞的共刺激作用和寻找其未知受体奠定良好的物质基础.
위획득인4IgB7-H3-Fc융합단백,연구기대T세포적공자격작용,채용PCR기술분별종pMD18-T/4IgB7-H3화pMD18-T/hIgG1(Fc)중조재체중확증출인4IgB7-H3포외단기인화인IgG1 중련Fc항정구기인,통과RT-PCR기술삽입역전록병독재체pGEZ-Term,중조역전록병독재체여량개보조병독재체경지질체법공전염포장세포293T,수집함유완정병독과립적293T세포적배양상청반복감염L929 세포,이용Zeocin 사선획득능은정분비4IgB7-H3-Fc융합단백적기인전염세포.기인전염세포경무혈청배양후,수집적상청용Dot blot검측,초려농축병경Protein G주순화,재용SDS-PAGE、Western blot 감정.이4IgB7-H3-Fc단백검측활화T세포표면미지수체적표체,통과MTT방법분석4IgB7-H3-Fc융합단백대T세포적공자격작용.결과현시,성공지구건료pEGZ-Term/4IgB7-H3-Fc중조역전록병독재체,경전염포장세포293T 후,사선획득능은정분비4IgB7-H3-Fc단백적L929기인전염세포주;순화후적4IgB7-H3-Fc단백능구여활화T세포표면결합,병대T세포유현저적촉증식작용.위탐토인4IgB7-H3-Fc융합단백대T세포적공자격작용화심조기미지수체전정량호적물질기출.