中国药理学通报
中國藥理學通報
중국약이학통보
CHINESE PHARMACOLOGICAL BULLETIN
2008年
1期
91-95
,共5页
鲁云霞%李俊%章秋%徐元宏%陈兵%张吕钊%孙玉诚
魯雲霞%李俊%章鞦%徐元宏%陳兵%張呂釗%孫玉誠
로운하%리준%장추%서원굉%진병%장려쇠%손옥성
蛋白酪氨酸磷酸酶1B%cDNA%pET-28a(+)%高效表达%包涵体
蛋白酪氨痠燐痠酶1B%cDNA%pET-28a(+)%高效錶達%包涵體
단백락안산린산매1B%cDNA%pET-28a(+)%고효표체%포함체
目的 构建人蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)基因cDNA全长的原核表达质粒(pET-28a(+)-hPTP1B)并在大肠杆菌中高效表达.方法 取2型糖尿病人(BMI＞28 kg·m-2)的淋巴细胞提取总RNA,RT-PCR后的扩增产物回收构建克隆载体pMD-hPTP1B,测序后设计带酶切位点BamHⅠ和EcoRⅠ的引物,PCR后酶切连入pET-28a(+)中,转化DE3,IPTG诱导表达,SDS-PAGE后用Western blot检测其特异表达,并进一步对rhPTP1B诱导表达时IPTG的浓度、时间和温度等条件进行了优化.结果 测序证实所得的hPTP1BcDNA序列与其在GenBank中的序列一致,重组质粒pET-28a(+)-hPTP1B的双酶切结果与预期大小完全一致,IPTG诱导后高效表达的蛋白质是其不溶性的包涵体形式.IPTG诱导的最佳浓度是0.05 mmol·L-1,时间为5 h,温度为37℃.结论 成功克隆了人PTP1B基因,构建了相应的原核表达载体并对原核体系诱导表达的条件进行了优化,使其能在DE3中高效表达,为筛选高特异的小分子抑制剂和制备相应的单克隆抗体打下坚实的基础.
目的 構建人蛋白酪氨痠燐痠酶1B(PTP1B)基因cDNA全長的原覈錶達質粒(pET-28a(+)-hPTP1B)併在大腸桿菌中高效錶達.方法 取2型糖尿病人(BMI＞28 kg·m-2)的淋巴細胞提取總RNA,RT-PCR後的擴增產物迴收構建剋隆載體pMD-hPTP1B,測序後設計帶酶切位點BamHⅠ和EcoRⅠ的引物,PCR後酶切連入pET-28a(+)中,轉化DE3,IPTG誘導錶達,SDS-PAGE後用Western blot檢測其特異錶達,併進一步對rhPTP1B誘導錶達時IPTG的濃度、時間和溫度等條件進行瞭優化.結果 測序證實所得的hPTP1BcDNA序列與其在GenBank中的序列一緻,重組質粒pET-28a(+)-hPTP1B的雙酶切結果與預期大小完全一緻,IPTG誘導後高效錶達的蛋白質是其不溶性的包涵體形式.IPTG誘導的最佳濃度是0.05 mmol·L-1,時間為5 h,溫度為37℃.結論 成功剋隆瞭人PTP1B基因,構建瞭相應的原覈錶達載體併對原覈體繫誘導錶達的條件進行瞭優化,使其能在DE3中高效錶達,為篩選高特異的小分子抑製劑和製備相應的單剋隆抗體打下堅實的基礎.
목적 구건인단백락안산린산매1B(PTP1B)기인cDNA전장적원핵표체질립(pET-28a(+)-hPTP1B)병재대장간균중고효표체.방법 취2형당뇨병인(BMI＞28 kg·m-2)적림파세포제취총RNA,RT-PCR후적확증산물회수구건극륭재체pMD-hPTP1B,측서후설계대매절위점BamHⅠ화EcoRⅠ적인물,PCR후매절련입pET-28a(+)중,전화DE3,IPTG유도표체,SDS-PAGE후용Western blot검측기특이표체,병진일보대rhPTP1B유도표체시IPTG적농도、시간화온도등조건진행료우화.결과 측서증실소득적hPTP1BcDNA서렬여기재GenBank중적서렬일치,중조질립pET-28a(+)-hPTP1B적쌍매절결과여예기대소완전일치,IPTG유도후고효표체적단백질시기불용성적포함체형식.IPTG유도적최가농도시0.05 mmol·L-1,시간위5 h,온도위37℃.결론 성공극륭료인PTP1B기인,구건료상응적원핵표체재체병대원핵체계유도표체적조건진행료우화,사기능재DE3중고효표체,위사선고특이적소분자억제제화제비상응적단극륭항체타하견실적기출.
