CAJ | 학술논문

超分支滚环扩增技术(Hyperbranched rolling cycle amplification, HRCA)在近几年中逐渐引起人们的注意,并越来越多的用于基础研究和实际检测中.在本文中我们对该技术在转基因植物检测中的应用情况作了较全面的探索;根据4种转基因植物中常用的外源基因或DNA片段设计了4条锁式探针(Padlock probe),利用质粒pKK232-8中的一段序列作为锁式探针中的共同连接部分,并根据该共同的连接部分序列设计一对通用的HRCA引物;利用同位素标记的锁式探针对HRCA反应中的连接一步的特异性研究表明,只有当锁式探针和相应的检测靶DNA同时存在于连接体系中时,锁式探针才能被有效地进行连接,从线性分子变为环型分子,在没有相应靶DNA存在时锁式探针仅以线性形式存在;连接时间的研究表明,如果所检测的靶DNA是质粒或较短的DNA片段时,较短的连接时间(5～10min)就可以取得理想的最终检测效果,如果检测的靶DNA是复杂的植物基因组DNA时,连接时间需要较大程度的延长(30～60min)才能取得理想的最终检测结果;HRCA的反应时间研究表明,较长的反应时间可以明显增加最终产物的量;对Bst DNA聚合酶大片段酶用量的研究表明,在其它条件不变的情况下酶的用量可以在较大的范围内变化(0.5u～4u)而不影响最终检测结果;在上述研究的基础上,对转基因烟草进行实际检测,取得了与预期一致的理想结果.为了提高检测效率,仿效复合式PCR(Multiplex PCR,MPCR)的原理采用复合式HRCA(Multiplex HRCA, MHRCA)方法对转基因烟草进行检测,并利用反向点杂交进行结果分析,取得同预期完全一致的结果.我们的研究表明HRCA方法完全可以用于转基因植物的检测,而且其使用比MPCR技术更方便,效率更高.
초분지곤배확증기술(Hyperbranched rolling cycle amplification, HRCA)재근궤년중축점인기인문적주의,병월래월다적용우기출연구화실제검측중.재본문중아문대해기술재전기인식물검측중적응용정황작료교전면적탐색;근거4충전기인식물중상용적외원기인혹DNA편단설계료4조쇄식탐침(Padlock probe),이용질립pKK232-8중적일단서렬작위쇄식탐침중적공동련접부분,병근거해공동적련접부분서렬설계일대통용적HRCA인물;이용동위소표기적쇄식탐침대HRCA반응중적련접일보적특이성연구표명,지유당쇄식탐침화상응적검측파DNA동시존재우련접체계중시,쇄식탐침재능피유효지진행련접,종선성분자변위배형분자,재몰유상응파DNA존재시쇄식탐침부이선성형식존재;련접시간적연구표명,여과소검측적파DNA시질립혹교단적DNA편단시,교단적련접시간(5～10min)취가이취득이상적최종검측효과,여과검측적파DNA시복잡적식물기인조DNA시,련접시간수요교대정도적연장(30～60min)재능취득이상적최종검측결과;HRCA적반응시간연구표명,교장적반응시간가이명현증가최종산물적량;대Bst DNA취합매대편단매용량적연구표명,재기타조건불변적정황하매적용량가이재교대적범위내변화(0.5u～4u)이불영향최종검측결과;재상술연구적기출상,대전기인연초진행실제검측,취득료여예기일치적이상결과.위료제고검측효솔,방효복합식PCR(Multiplex PCR,MPCR)적원리채용복합식HRCA(Multiplex HRCA, MHRCA)방법대전기인연초진행검측,병이용반향점잡교진행결과분석,취득동예기완전일치적결과.아문적연구표명HRCA방법완전가이용우전기인식물적검측,이차기사용비MPCR기술경방편,효솔경고.