CAJ | 학술논문

背景:神经元是中枢神经系统起主导功能的细胞,培养干细胞的最终目的是获得相应表型的神经元,从而促进中枢神经系统损伤的修复.但以往相关文献显示神经干细胞分化为神绛元的比例不到30%.目的:以脑源性神经营养因子作为诱导分化剂.观察其对胎鼠源性神经干细胞向神经元方向分化的作用.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于 2006-0612007-08在南京医科大学第一附属医院中心实验室完成.材料:清洁级孕14～17 d的SD大鼠10只,诱导分化剂脑源性神经营养因子为Peprotech产品,胎牛血清为杭州四季青产品.方法:孕鼠处死后取出胚胎,剪碎后机械法体外分离培养神经干细胞,锥虫蓝染色计数,调整细胞密度为2×106,添加B27及碱性成纤维细胞生长因子,置于37℃、体积分数为0.05的CO2恒温箱中原代培养,待细胞克隆球明显增大、中央变暗时传代扩增.将培养所得的于细胞克隆球分为2组,诱导组添加体积分数为0.01的胎牛血清+20μg/L脑源性神经营养因子共培养,血清对照组仅添加体积分数为0.01的胎牛血清.主要观察指标:在倒置显微镜下观察细胞生长、贴壁和分化情况.诱导分化5 d后,行神经元免疫组化鉴定,流式细胞仪检测神经元阳性细胞率.取原代培养未分化的神经干细胞及诱导分化3 d的两组细胞,RT-PCR检测内源性bHLH基因MASH-1的表达.结果:原代培养可获得数十至数百个神经干细胞聚集在一起的神经克降球,形态规则,立体感强:悬浮生长的克隆球经诱导分化后,逐渐失去其球状的立体外观,邻近克隆球发出的突起可相互连接,3 d后即有神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞从克隆周围出现,培养的神经干细胞呈巢蛋白阳性表达,诱导分化后呈微管相关蛋白2阳性表达.与血清对照组比较,诱导组神经元阳性细胞率显著升高(x2=16.0.P<0.05).与未分化的神经干细胞比较,诱导组、血清对照组细胞MASH-1的表达均明显升高,且前者升高幅度明显强于后者(F=21.7,P<0.05).结论:脑源性神经营养因子能促进神经干细胞向神经元方向分化,可能与内源性bHLH基因MASH-1的表达升高有关. 揹景:神經元是中樞神經繫統起主導功能的細胞,培養榦細胞的最終目的是穫得相應錶型的神經元,從而促進中樞神經繫統損傷的脩複.但以往相關文獻顯示神經榦細胞分化為神絳元的比例不到30%.目的:以腦源性神經營養因子作為誘導分化劑.觀察其對胎鼠源性神經榦細胞嚮神經元方嚮分化的作用.設計、時間及地點:細胞學體外觀察,于 2006-0612007-08在南京醫科大學第一附屬醫院中心實驗室完成.材料:清潔級孕14～17 d的SD大鼠10隻,誘導分化劑腦源性神經營養因子為Peprotech產品,胎牛血清為杭州四季青產品.方法:孕鼠處死後取齣胚胎,剪碎後機械法體外分離培養神經榦細胞,錐蟲藍染色計數,調整細胞密度為2×106,添加B27及堿性成纖維細胞生長因子,置于37℃、體積分數為0.05的CO2恆溫箱中原代培養,待細胞剋隆毬明顯增大、中央變暗時傳代擴增.將培養所得的于細胞剋隆毬分為2組,誘導組添加體積分數為0.01的胎牛血清+20μg/L腦源性神經營養因子共培養,血清對照組僅添加體積分數為0.01的胎牛血清.主要觀察指標:在倒置顯微鏡下觀察細胞生長、貼壁和分化情況.誘導分化5 d後,行神經元免疫組化鑒定,流式細胞儀檢測神經元暘性細胞率.取原代培養未分化的神經榦細胞及誘導分化3 d的兩組細胞,RT-PCR檢測內源性bHLH基因MASH-1的錶達.結果:原代培養可穫得數十至數百箇神經榦細胞聚集在一起的神經剋降毬,形態規則,立體感彊:懸浮生長的剋隆毬經誘導分化後,逐漸失去其毬狀的立體外觀,鄰近剋隆毬髮齣的突起可相互連接,3 d後即有神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞從剋隆週圍齣現,培養的神經榦細胞呈巢蛋白暘性錶達,誘導分化後呈微管相關蛋白2暘性錶達.與血清對照組比較,誘導組神經元暘性細胞率顯著升高(x2=16.0.P<0.05).與未分化的神經榦細胞比較,誘導組、血清對照組細胞MASH-1的錶達均明顯升高,且前者升高幅度明顯彊于後者(F=21.7,P<0.05).結論:腦源性神經營養因子能促進神經榦細胞嚮神經元方嚮分化,可能與內源性bHLH基因MASH-1的錶達升高有關.
배경:신경원시중추신경계통기주도공능적세포,배양간세포적최종목적시획득상응표형적신경원,종이촉진중추신경계통손상적수복.단이왕상관문헌현시신경간세포분화위신강원적비례불도30%.목적:이뇌원성신경영양인자작위유도분화제.관찰기대태서원성신경간세포향신경원방향분화적작용.설계、시간급지점:세포학체외관찰,우 2006-0612007-08재남경의과대학제일부속의원중심실험실완성.재료:청길급잉14～17 d적SD대서10지,유도분화제뇌원성신경영양인자위Peprotech산품,태우혈청위항주사계청산품.방법:잉서처사후취출배태,전쇄후궤계법체외분리배양신경간세포,추충람염색계수,조정세포밀도위2×106,첨가B27급감성성섬유세포생장인자,치우37℃、체적분수위0.05적CO2항온상중원대배양,대세포극륭구명현증대、중앙변암시전대확증.장배양소득적우세포극륭구분위2조,유도조첨가체적분수위0.01적태우혈청+20μg/L뇌원성신경영양인자공배양,혈청대조조부첨가체적분수위0.01적태우혈청.주요관찰지표:재도치현미경하관찰세포생장、첩벽화분화정황.유도분화5 d후,행신경원면역조화감정,류식세포의검측신경원양성세포솔.취원대배양미분화적신경간세포급유도분화3 d적량조세포,RT-PCR검측내원성bHLH기인MASH-1적표체.결과:원대배양가획득수십지수백개신경간세포취집재일기적신경극강구,형태규칙,입체감강:현부생장적극륭구경유도분화후,축점실거기구상적입체외관,린근극륭구발출적돌기가상호련접,3 d후즉유신경원、성형효질세포화소돌효질세포종극륭주위출현,배양적신경간세포정소단백양성표체,유도분화후정미관상관단백2양성표체.여혈청대조조비교,유도조신경원양성세포솔현저승고(x2=16.0.P<0.05).여미분화적신경간세포비교,유도조、혈청대조조세포MASH-1적표체균명현승고,차전자승고폭도명현강우후자(F=21.7,P<0.05).결론:뇌원성신경영양인자능촉진신경간세포향신경원방향분화,가능여내원성bHLH기인MASH-1적표체승고유관.