CAJ | 학술논문

目的:构建含hFVII-LC+hIgG1-Fc cDNA的重组真核表达载体,并转染中国仓鼠卵巢细胞亚株CHO-K1获得以组织因子(TF)为靶点的免疫治疗结合物用于肿瘤的靶向治疗.方法:用分子生物学方法从汉族人肝组织和淋巴细胞中分别获得hFVII-LC和hIgG1-Fc DNA片段并用连接酶正向克隆入真核表达质粒pcDNA3.1(+)中.以脂质体法转染阳性质粒入CHO-K1细胞,G418加压筛选获得阳性单克隆细胞;Excel 301无血清培养液扩大培养,培养液Ni-NTA亲和层析纯化和制备hFVIII-LC+hIgG1-Fc融合蛋白,ELISA法检测该融合蛋白与TF的靶向作用,免疫激活物与结肠癌细胞HT-29及NK细胞混合培养检测结合物激活NK细胞的能力.结果:以汉族人肝组织和淋巴细胞为模板扩增的hFVII-LC和hIgG1-Fc DNA片段经测序证实与基因库报道的系列完全一致;经酶切分析、测序证实构建的hFVII-LC+hIgG1-Fc融合基因片段完整地落在真核表达质粒pcDNA3.1(+)的阅读框架中;LipofectamineTM 2000转染试剂能获得含pcDNA3.1(+)-hFVII-LC+hIgG1-Fc阳性的CHO-K1细胞,经1 g/L G418加压筛选可以获得分泌hFVII-LC+hIgG1-Fc融合蛋白的单克隆细胞株;1L Excel 301无血清培养液用Ni-NTA亲和层析纯化可以制备1.3 mg hFVII-LC+hIgG1-Fc融合蛋白,经ELISA法鉴定与TF具有高亲和力,免疫激活物与结肠癌细胞HT-29及NK细胞混合培养表现出明显的激活NK细胞的能力.结论:成功构建了hFVII-LC+hIgG1-Fc融合蛋白的真核表达载体并获得了分泌hFVII-LC+hIgG1-Fc融合蛋白的CHO-K1单克隆细胞株,为制备以TF为靶点的肿瘤免疫治疗结合物奠定了基础.
목적:구건함hFVII-LC+hIgG1-Fc cDNA적중조진핵표체재체,병전염중국창서란소세포아주CHO-K1획득이조직인자(TF)위파점적면역치료결합물용우종류적파향치료.방법:용분자생물학방법종한족인간조직화림파세포중분별획득hFVII-LC화hIgG1-Fc DNA편단병용련접매정향극륭입진핵표체질립pcDNA3.1(+)중.이지질체법전염양성질립입CHO-K1세포,G418가압사선획득양성단극륭세포;Excel 301무혈청배양액확대배양,배양액Ni-NTA친화층석순화화제비hFVIII-LC+hIgG1-Fc융합단백,ELISA법검측해융합단백여TF적파향작용,면역격활물여결장암세포HT-29급NK세포혼합배양검측결합물격활NK세포적능력.결과:이한족인간조직화림파세포위모판확증적hFVII-LC화hIgG1-Fc DNA편단경측서증실여기인고보도적계렬완전일치;경매절분석、측서증실구건적hFVII-LC+hIgG1-Fc융합기인편단완정지락재진핵표체질립pcDNA3.1(+)적열독광가중;LipofectamineTM 2000전염시제능획득함pcDNA3.1(+)-hFVII-LC+hIgG1-Fc양성적CHO-K1세포,경1 g/L G418가압사선가이획득분비hFVII-LC+hIgG1-Fc융합단백적단극륭세포주;1L Excel 301무혈청배양액용Ni-NTA친화층석순화가이제비1.3 mg hFVII-LC+hIgG1-Fc융합단백,경ELISA법감정여TF구유고친화력,면역격활물여결장암세포HT-29급NK세포혼합배양표현출명현적격활NK세포적능력.결론:성공구건료hFVII-LC+hIgG1-Fc융합단백적진핵표체재체병획득료분비hFVII-LC+hIgG1-Fc융합단백적CHO-K1단극륭세포주,위제비이TF위파점적종류면역치료결합물전정료기출.