用弱化dhfr双顺反子载体在CHO细胞中高效表达低分子量尿激酶突变体
용약화dhfr쌍순반자재체재CHO세포중고효표체저분자량뇨격매돌변체
High-level expression of a low molecular weight urokinase variant with attenuated dhfr bicistronic vector in CHO cells
  • 万方数据
    高技术通讯 고기술통신
    HIGH TECHNOLOGY LETTERS
    2006年 8期 834-840 ,共7页

    潘淑媛%高丽华%胡显文%杨波%殷亮%胥照平%张正光%郗永义%陈惠鹏

    반숙원%고려화%호현문%양파%은량%서조평%장정광%치영의%진혜붕

    低分子量尿激酶%突变体%内部核糖体进入位点%二氢叶酸还原酶基因%重组CHO细胞 低分子量尿激酶%突變體%內部覈糖體進入位點%二氫葉痠還原酶基因%重組CHO細胞
    저분자량뇨격매%돌변체%내부핵당체진입위점%이경협산환원매기인%중조CHO세포
    将二氢叶酸还原酶基因(dhfr)克隆至pIRES载体中弱化的脑心肌炎病毒(ECMV)内部核糖体进入位点(IRES)的下游,构建了含有弱化dhfr筛选标记和可用氨甲蝶呤(MTX)加压提高表达水平的双顺反子真核表达载体pIRES-dhfr.利用该表达载体表达了一种无糖基化和具有凝血酶抗性的低分子量尿激酶型纤溶酶原激活剂(LMW-uPA)突变体(缺失尿激酶原的1-143位氨基酸,Arg156→Lys,Asn302→Ala),用脂质体转染方法将表达载体pIRES-dhfr/LMW-UK转染CHO-dhfr-细胞后经过一轮MTX筛选,几乎所有获得的单克隆细胞株都表达LMW-UK,其中约50%为表达水平较接近(500-5000 IU/106cells/d)的高表达阳性克隆.用转瓶无血清培养表达水平约为17.5pg/cell/d的rCHO细胞系LB2-UK,收集的上清经过阳离子交换柱和凝胶过滤层析两步纯化后,获得的重组蛋白的纯度可以达到99%.用S-2444发色底物法检测,所获得的突变体双链UK比例大于98%.
    장이경협산환원매기인(dhfr)극륭지pIRES재체중약화적뇌심기염병독(ECMV)내부핵당체진입위점(IRES)적하유,구건료함유약화dhfr사선표기화가용안갑접령(MTX)가압제고표체수평적쌍순반자진핵표체재체pIRES-dhfr.이용해표체재체표체료일충무당기화화구유응혈매항성적저분자량뇨격매형섬용매원격활제(LMW-uPA)돌변체(결실뇨격매원적1-143위안기산,Arg156→Lys,Asn302→Ala),용지질체전염방법장표체재체pIRES-dhfr/LMW-UK전염CHO-dhfr-세포후경과일륜MTX사선,궤호소유획득적단극륭세포주도표체LMW-UK,기중약50%위표체수평교접근(500-5000 IU/106cells/d)적고표체양성극륭.용전병무혈청배양표체수평약위17.5pg/cell/d적rCHO세포계LB2-UK,수집적상청경과양리자교환주화응효과려층석량보순화후,획득적중조단백적순도가이체도99%.용S-2444발색저물법검측,소획득적돌변체쌍련UK비례대우98%.
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