CAJ | 학술논문

目的构建人低氧诱导因子-1α(HIF-1α)真核表达载体pcDNA3.1+-HIF-1α的两种突变体pcDNA3.1+-HIF-1α-564Ala和pcDNA3.1+-HIF-1αt-564Ala-803Ala,并检测它们在人肺微血管内皮细胞(HMVECs)中的表达.方法用定点突变的方法将pcDNA3.1+-HIF-1α的HIF-1α第564位脯氨酸(Pro)密码子CCC突变为丙氨酸(Ala)密码子GCC,构建成单个突变HIF-1α真核表达载体pcDNA3.1+-HIF-1α-564Ala.在第一次突变的基础上,仍然用定点突变的方法将pcDNA3.1+-HIF-1αt-564A1a的HIF-1α-564Ala第803位天冬酰胺(Asn)密码子ATT突变为丙氨酸(Ala)密码子GCT,构建成双个点突变HIF-1α真核表达载体pcDNA3.1+-HIF-1α-564Ala-803Ala.将3种HIF-1α表达载体用脂质体法分别转入HMVECs,以RT-PCR、免疫荧光法和Western blotting法分别对转染细胞进行表达分析.结果测序证实,定点突变成功,构建成重组真核表达载体pcDNA3.1+-HIF-1α-564Ala和pcDNA3.1+-HIF-1α-564Ala-803Ala;3种载体均能表达相应的蛋白和mRNA,但转化突变HIF-1α表达载体的细胞蛋白量比空白细胞和转化无突变HIF-1α载体的细胞显著增加.结论成功构建能够在HMVECs中表达的单个和双个点突变的HIF-1α基因的真核表达载体.
목적구건인저양유도인자-1α(HIF-1α)진핵표체재체pcDNA3.1+-HIF-1α적량충돌변체pcDNA3.1+-HIF-1α-564Ala화pcDNA3.1+-HIF-1αt-564Ala-803Ala,병검측타문재인폐미혈관내피세포(HMVECs)중적표체.방법용정점돌변적방법장pcDNA3.1+-HIF-1α적HIF-1α제564위포안산(Pro)밀마자CCC돌변위병안산(Ala)밀마자GCC,구건성단개돌변HIF-1α진핵표체재체pcDNA3.1+-HIF-1α-564Ala.재제일차돌변적기출상,잉연용정점돌변적방법장pcDNA3.1+-HIF-1αt-564A1a적HIF-1α-564Ala제803위천동선알(Asn)밀마자ATT돌변위병안산(Ala)밀마자GCT,구건성쌍개점돌변HIF-1α진핵표체재체pcDNA3.1+-HIF-1α-564Ala-803Ala.장3충HIF-1α표체재체용지질체법분별전입HMVECs,이RT-PCR、면역형광법화Western blotting법분별대전염세포진행표체분석.결과측서증실,정점돌변성공,구건성중조진핵표체재체pcDNA3.1+-HIF-1α-564Ala화pcDNA3.1+-HIF-1α-564Ala-803Ala;3충재체균능표체상응적단백화mRNA,단전화돌변HIF-1α표체재체적세포단백량비공백세포화전화무돌변HIF-1α재체적세포현저증가.결론성공구건능구재HMVECs중표체적단개화쌍개점돌변적HIF-1α기인적진핵표체재체.