中国医药生物技术
中國醫藥生物技術
중국의약생물기술
CHINESE MEDICINAL BIOTECHNOLOGY
2010年
5期
353-356
,共4页
孙旭妍%陶敏芳%程蔚蔚%王玉东
孫旭妍%陶敏芳%程蔚蔚%王玉東
손욱연%도민방%정위위%왕옥동
成骨细胞%RNA%小分子干扰%雌激素受体β
成骨細胞%RNA%小分子榦擾%雌激素受體β
성골세포%RNA%소분자간우%자격소수체β
目的 构建雌激素受体β(ERβ)亚型沉寂表达载体,并观察其转染成骨细胞后抑制ERβ基因表达的效果.方法 参考人ERβ基因mRNA序列,设计、合成ERβ-shRNA的DNA Oligo后行PCR扩增,获得的shRNA双链DNA片段与pLVTHM-GFP质粒双酶切后连接,转化大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞.取鉴定正确的pLVTHM-GFP/ERβ-shRNA重组质粒转染人成骨hMG63细胞,实验分空白载体组、空白对照组和ERβ-siRNA组,转染48 h后于倒置荧光显微镜下观察各组细胞的转染效果,并采用流式细胞术检测转染效率.抽提各组细胞的总RNA,经RT-PCR生成cDNA,Realtime-PCR检测ERβ基因的抑制效率.结果 倒置荧光显微镜下观察显示,ERβ-siRNA组hMG63细胞90%以上呈现绿色荧光.流式细胞术检测ERβ-shRNA转染hMG63细胞的转染效率为92.3%.Realtime-PCR检测结果表明,ERβ-siRNA组ERβ表达量(0.17±0.01)仅约为空白载体组(1.00±0.01)的17.3%(P<0.001),ERβ-siRNA对hMG63细胞ERβ基因的抑制效率约为83%.结论 成功建立了人ERβ沉寂表达的成骨细胞模型,慢病毒载体介导的ERβ-siRNA能有效抑制成骨细胞ERβ基因的表达,满足了研究成骨细胞中ERβ相关功能的需要.
目的 構建雌激素受體β(ERβ)亞型沉寂錶達載體,併觀察其轉染成骨細胞後抑製ERβ基因錶達的效果.方法 參攷人ERβ基因mRNA序列,設計、閤成ERβ-shRNA的DNA Oligo後行PCR擴增,穫得的shRNA雙鏈DNA片段與pLVTHM-GFP質粒雙酶切後連接,轉化大腸桿菌E.coli DH5α感受態細胞.取鑒定正確的pLVTHM-GFP/ERβ-shRNA重組質粒轉染人成骨hMG63細胞,實驗分空白載體組、空白對照組和ERβ-siRNA組,轉染48 h後于倒置熒光顯微鏡下觀察各組細胞的轉染效果,併採用流式細胞術檢測轉染效率.抽提各組細胞的總RNA,經RT-PCR生成cDNA,Realtime-PCR檢測ERβ基因的抑製效率.結果 倒置熒光顯微鏡下觀察顯示,ERβ-siRNA組hMG63細胞90%以上呈現綠色熒光.流式細胞術檢測ERβ-shRNA轉染hMG63細胞的轉染效率為92.3%.Realtime-PCR檢測結果錶明,ERβ-siRNA組ERβ錶達量(0.17±0.01)僅約為空白載體組(1.00±0.01)的17.3%(P<0.001),ERβ-siRNA對hMG63細胞ERβ基因的抑製效率約為83%.結論 成功建立瞭人ERβ沉寂錶達的成骨細胞模型,慢病毒載體介導的ERβ-siRNA能有效抑製成骨細胞ERβ基因的錶達,滿足瞭研究成骨細胞中ERβ相關功能的需要.
목적 구건자격소수체β(ERβ)아형침적표체재체,병관찰기전염성골세포후억제ERβ기인표체적효과.방법 삼고인ERβ기인mRNA서렬,설계、합성ERβ-shRNA적DNA Oligo후행PCR확증,획득적shRNA쌍련DNA편단여pLVTHM-GFP질립쌍매절후련접,전화대장간균E.coli DH5α감수태세포.취감정정학적pLVTHM-GFP/ERβ-shRNA중조질립전염인성골hMG63세포,실험분공백재체조、공백대조조화ERβ-siRNA조,전염48 h후우도치형광현미경하관찰각조세포적전염효과,병채용류식세포술검측전염효솔.추제각조세포적총RNA,경RT-PCR생성cDNA,Realtime-PCR검측ERβ기인적억제효솔.결과 도치형광현미경하관찰현시,ERβ-siRNA조hMG63세포90%이상정현록색형광.류식세포술검측ERβ-shRNA전염hMG63세포적전염효솔위92.3%.Realtime-PCR검측결과표명,ERβ-siRNA조ERβ표체량(0.17±0.01)부약위공백재체조(1.00±0.01)적17.3%(P<0.001),ERβ-siRNA대hMG63세포ERβ기인적억제효솔약위83%.결론 성공건립료인ERβ침적표체적성골세포모형,만병독재체개도적ERβ-siRNA능유효억제성골세포ERβ기인적표체,만족료연구성골세포중ERβ상관공능적수요.
