云南农业大学学报
雲南農業大學學報
운남농업대학학보
JOURNAL OF YUNNAN AGRICULTURAL UNIVERSITY
2012年
4期
530-534
,共5页
高斌%冯励%李永强%付晓萍
高斌%馮勵%李永彊%付曉萍
고빈%풍려%리영강%부효평
猪瘟病毒%Npro基因%真核表达
豬瘟病毒%Npro基因%真覈錶達
저온병독%Npro기인%진핵표체
为了得到一个表达Npro蛋白的真核表达载体,从而为下一步研究不同时间段细胞主要组织相容性复合体( MHC)表达的变化情况,从分子水平上说明Npro与MHC之间的关系,本研究应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术对猪瘟病毒石门毒株Npro基因进行了克降和测序,结果得到了长度为592 bp的目的片段.用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ限制性内切酶分别对重组克隆质粒和转移载体pcDNA3.0进行双酶切,回收目的基因DNA片段,将目的基因Npro亚克隆至真核转移载体pcDNA3.0中,经双酶切和序列测定鉴定插入基因和连接方向正确,得到含完整Npro基因的重组载体质粒p-Npro.构建成功的真核表达载体以脂质体介导的转染方法将此重组载体质粒转染PK-15细胞,转染24和48 h后检测表达情况.经Western-blot方法检测表明,此Npro蛋白在PK-15细胞中正确表达.
為瞭得到一箇錶達Npro蛋白的真覈錶達載體,從而為下一步研究不同時間段細胞主要組織相容性複閤體( MHC)錶達的變化情況,從分子水平上說明Npro與MHC之間的關繫,本研究應用反轉錄聚閤酶鏈式反應(RT-PCR)技術對豬瘟病毒石門毒株Npro基因進行瞭剋降和測序,結果得到瞭長度為592 bp的目的片段.用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ限製性內切酶分彆對重組剋隆質粒和轉移載體pcDNA3.0進行雙酶切,迴收目的基因DNA片段,將目的基因Npro亞剋隆至真覈轉移載體pcDNA3.0中,經雙酶切和序列測定鑒定插入基因和連接方嚮正確,得到含完整Npro基因的重組載體質粒p-Npro.構建成功的真覈錶達載體以脂質體介導的轉染方法將此重組載體質粒轉染PK-15細胞,轉染24和48 h後檢測錶達情況.經Western-blot方法檢測錶明,此Npro蛋白在PK-15細胞中正確錶達.
위료득도일개표체Npro단백적진핵표체재체,종이위하일보연구불동시간단세포주요조직상용성복합체( MHC)표체적변화정황,종분자수평상설명Npro여MHC지간적관계,본연구응용반전록취합매련식반응(RT-PCR)기술대저온병독석문독주Npro기인진행료극강화측서,결과득도료장도위592 bp적목적편단.용BamH Ⅰ화Xho Ⅰ한제성내절매분별대중조극륭질립화전이재체pcDNA3.0진행쌍매절,회수목적기인DNA편단,장목적기인Npro아극륭지진핵전이재체pcDNA3.0중,경쌍매절화서렬측정감정삽입기인화련접방향정학,득도함완정Npro기인적중조재체질립p-Npro.구건성공적진핵표체재체이지질체개도적전염방법장차중조재체질립전염PK-15세포,전염24화48 h후검측표체정황.경Western-blot방법검측표명,차Npro단백재PK-15세포중정학표체.
