中华检验医学杂志
中華檢驗醫學雜誌
중화검험의학잡지
CHINESE JOURNAL OF LABORATORY MEDICINE
2005年
4期
417-422
,共6页
梁敏坚%洪国强%李朝霞%胡波%许珏%李林
樑敏堅%洪國彊%李朝霞%鬍波%許玨%李林
량민견%홍국강%리조하%호파%허각%리림
肝炎核心抗原,乙型%基因表达%毕赤酵母%酶联免疫吸附测定
肝炎覈心抗原,乙型%基因錶達%畢赤酵母%酶聯免疫吸附測定
간염핵심항원,을형%기인표체%필적효모%매련면역흡부측정
目的在毕赤酵母中表达出高免疫反应性和特异性的重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg),探讨该表达产物在乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)免疫检测中的应用.方法用PCR从含有乙型肝炎病毒DNA模板的质粒中扩增出编码HBcAg 的C基因,插入pPIC9酵母表达载体.携带有C片段的pPIC9转化毕赤酵母菌株GS115,经甲醇诱导表达HBcAg.分别用分子筛纯化毕赤酵母表达的HBcAg(A)、单克隆HBcAb特异结合纯化毕赤表达的HBcAg(B)、分子筛纯化大肠杆菌表达的HBcAg(C)、单克隆HBcAb特异结合纯化大肠杆菌表达的HBcAg(D)作为固相抗原,辣根过氧化物酶标记多克隆HBcAb为探测抗体,用竞争抑制法酶联免疫吸附测定(competitive inhibition ELISA)检测HBcAb标准品及含有乙型肝炎病毒PCR阳性和阴性血清的临床标本.结果聚丙烯酰胺凝胶电泳、immunoblot、ELISA显示HBcAg在毕赤酵母中高效表达;分别用抗原A、B、C、D制备的试剂检测中国药品生物制品检定所HBcAb国家参考品:试剂A与B结果相同: 阴性符合率(-/-)15/15,阳性符合率(+/+)15/15;最低检出量(稀释度):灵敏度参考品?=1∶ 128,3#=1∶ 16,4#=1∶ 64.试剂C与D结果相同:阴性符合率(-/-)15/15;阳性符合率(+/+)14/15;最低检出量(稀释度):灵敏度参考品2#=1∶ 32;3#=1∶ 16;4#=1∶ 32;大肠杆菌抗原的灵敏度明显低于毕赤酵母抗原.对乙型肝炎病毒PCR阳性及阴性的临床标本进行检测,结果如下: PCR阳性组HBcAb阳性检出率:试剂A 97.8%; 试剂B 98.1%;试剂C 96.6%;试剂D 91.4%;A、B、C三组间比较差异无统计学意义(P＞0.05);D分别与A、B、C相比较差异均有统计学意义(P＜0.005).PCR阴性组HBcAb阴性检出率:试剂A 80.3%;试剂B 80.9%;试剂C 75.0%;试剂D 85.7%;AB两组比较差异无统计学意义(P＞0.05); AC、AD、BC,BD、CD相比较差异均有统计学意义(P＜0.005);分子筛纯化的大肠杆菌HBcAg含有干扰检测的杂质,结果出现假阳性;大肠杆菌HBcAg存在表位缺失导致结果出现假阴性.结论毕赤酵母表达系统高效表达出具有良好免疫反应性和特异性的HBcAg,用于HBcAb的检测灵敏度及特异性均优于大肠杆菌表达产物.
目的在畢赤酵母中錶達齣高免疫反應性和特異性的重組乙型肝炎病毒覈心抗原(HBcAg),探討該錶達產物在乙型肝炎病毒覈心抗體(HBcAb)免疫檢測中的應用.方法用PCR從含有乙型肝炎病毒DNA模闆的質粒中擴增齣編碼HBcAg 的C基因,插入pPIC9酵母錶達載體.攜帶有C片段的pPIC9轉化畢赤酵母菌株GS115,經甲醇誘導錶達HBcAg.分彆用分子篩純化畢赤酵母錶達的HBcAg(A)、單剋隆HBcAb特異結閤純化畢赤錶達的HBcAg(B)、分子篩純化大腸桿菌錶達的HBcAg(C)、單剋隆HBcAb特異結閤純化大腸桿菌錶達的HBcAg(D)作為固相抗原,辣根過氧化物酶標記多剋隆HBcAb為探測抗體,用競爭抑製法酶聯免疫吸附測定(competitive inhibition ELISA)檢測HBcAb標準品及含有乙型肝炎病毒PCR暘性和陰性血清的臨床標本.結果聚丙烯酰胺凝膠電泳、immunoblot、ELISA顯示HBcAg在畢赤酵母中高效錶達;分彆用抗原A、B、C、D製備的試劑檢測中國藥品生物製品檢定所HBcAb國傢參攷品:試劑A與B結果相同: 陰性符閤率(-/-)15/15,暘性符閤率(+/+)15/15;最低檢齣量(稀釋度):靈敏度參攷品?=1∶ 128,3#=1∶ 16,4#=1∶ 64.試劑C與D結果相同:陰性符閤率(-/-)15/15;暘性符閤率(+/+)14/15;最低檢齣量(稀釋度):靈敏度參攷品2#=1∶ 32;3#=1∶ 16;4#=1∶ 32;大腸桿菌抗原的靈敏度明顯低于畢赤酵母抗原.對乙型肝炎病毒PCR暘性及陰性的臨床標本進行檢測,結果如下: PCR暘性組HBcAb暘性檢齣率:試劑A 97.8%; 試劑B 98.1%;試劑C 96.6%;試劑D 91.4%;A、B、C三組間比較差異無統計學意義(P＞0.05);D分彆與A、B、C相比較差異均有統計學意義(P＜0.005).PCR陰性組HBcAb陰性檢齣率:試劑A 80.3%;試劑B 80.9%;試劑C 75.0%;試劑D 85.7%;AB兩組比較差異無統計學意義(P＞0.05); AC、AD、BC,BD、CD相比較差異均有統計學意義(P＜0.005);分子篩純化的大腸桿菌HBcAg含有榦擾檢測的雜質,結果齣現假暘性;大腸桿菌HBcAg存在錶位缺失導緻結果齣現假陰性.結論畢赤酵母錶達繫統高效錶達齣具有良好免疫反應性和特異性的HBcAg,用于HBcAb的檢測靈敏度及特異性均優于大腸桿菌錶達產物.
목적재필적효모중표체출고면역반응성화특이성적중조을형간염병독핵심항원(HBcAg),탐토해표체산물재을형간염병독핵심항체(HBcAb)면역검측중적응용.방법용PCR종함유을형간염병독DNA모판적질립중확증출편마HBcAg 적C기인,삽입pPIC9효모표체재체.휴대유C편단적pPIC9전화필적효모균주GS115,경갑순유도표체HBcAg.분별용분자사순화필적효모표체적HBcAg(A)、단극륭HBcAb특이결합순화필적표체적HBcAg(B)、분자사순화대장간균표체적HBcAg(C)、단극륭HBcAb특이결합순화대장간균표체적HBcAg(D)작위고상항원,랄근과양화물매표기다극륭HBcAb위탐측항체,용경쟁억제법매련면역흡부측정(competitive inhibition ELISA)검측HBcAb표준품급함유을형간염병독PCR양성화음성혈청적림상표본.결과취병희선알응효전영、immunoblot、ELISA현시HBcAg재필적효모중고효표체;분별용항원A、B、C、D제비적시제검측중국약품생물제품검정소HBcAb국가삼고품:시제A여B결과상동: 음성부합솔(-/-)15/15,양성부합솔(+/+)15/15;최저검출량(희석도):령민도삼고품?=1∶ 128,3#=1∶ 16,4#=1∶ 64.시제C여D결과상동:음성부합솔(-/-)15/15;양성부합솔(+/+)14/15;최저검출량(희석도):령민도삼고품2#=1∶ 32;3#=1∶ 16;4#=1∶ 32;대장간균항원적령민도명현저우필적효모항원.대을형간염병독PCR양성급음성적림상표본진행검측,결과여하: PCR양성조HBcAb양성검출솔:시제A 97.8%; 시제B 98.1%;시제C 96.6%;시제D 91.4%;A、B、C삼조간비교차이무통계학의의(P＞0.05);D분별여A、B、C상비교차이균유통계학의의(P＜0.005).PCR음성조HBcAb음성검출솔:시제A 80.3%;시제B 80.9%;시제C 75.0%;시제D 85.7%;AB량조비교차이무통계학의의(P＞0.05); AC、AD、BC,BD、CD상비교차이균유통계학의의(P＜0.005);분자사순화적대장간균HBcAg함유간우검측적잡질,결과출현가양성;대장간균HBcAg존재표위결실도치결과출현가음성.결론필적효모표체계통고효표체출구유량호면역반응성화특이성적HBcAg,용우HBcAb적검측령민도급특이성균우우대장간균표체산물.
