华中科技大学学报(医学版)
華中科技大學學報(醫學版)
화중과기대학학보(의학판)
JOURNAL OF HUAZHONG UNIVERSITY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY(HEALTH SCIENCES)
2010年
3期
305-310
,共6页
宋银宏%刘燕%牛力%翁秀芳%孙伟%于倩%吴雄文
宋銀宏%劉燕%牛力%翁秀芳%孫偉%于倩%吳雄文
송은굉%류연%우력%옹수방%손위%우천%오웅문
HLA-DR1%二聚体%杆状病毒载体%昆虫细胞%基因表达
HLA-DR1%二聚體%桿狀病毒載體%昆蟲細胞%基因錶達
HLA-DR1%이취체%간상병독재체%곤충세포%기인표체
目的 构建 HLA-DR1(由DRA和 DRB1*01 基因编码)杆状病毒表达载体,并使其在昆虫细胞内得到表达.方法 采用RT-PCR方法从721.221细胞中扩增DRα和DRβ的信号肽及胞外序列,运用重叠PCR将DRα和DRβ片段分别与Fos和Jun的亮氨酸拉链序列相连,成为DRα-Fos和DRβ-Jun,DRα和DRβ可凭借Fos和Jun的亮氨酸拉链结合形成DR1分子,再通过EcoR Ⅰ酶切位点将DRα-Fos和人IgG1的Fc段相连,形成DRα-Fos-Fc重组序列,2个同源的DR1分子可通过IgG1的Fc段的二硫键结合形成二聚体.分别将DRα-Fos-Fc及DRβ-Jun插入杆状病毒表达载体pFastBacTMDual的2个多克隆位点处,构建出重组载体pFast BacTMDual+[DR1/Fc].对构建的载体进行PCR及限制性内切酶酶切鉴定和测序.采用脂质体转染方法将表达载体转入昆虫细胞系Sf9中,通过双抗夹心ELISA及Western blot检测HLA-DR1的表达.结果 PCR及酶切鉴定和测序证实目的基因插入正确且序列与GenBank一致.ELISA和Western blot检测表明DR1杆状病毒感染的Sf9细胞培养上清HLA-DR1表达呈阳性,且表达的HLA-DR1分子具有正确的构象.结论 成功构建出杆状病毒表达载体pFastBacTMDual+[DR1/Fc],并在Sf9细胞中得到表达,为研究HLA-DR1限制性的T细胞应答奠定了基础.
目的 構建 HLA-DR1(由DRA和 DRB1*01 基因編碼)桿狀病毒錶達載體,併使其在昆蟲細胞內得到錶達.方法 採用RT-PCR方法從721.221細胞中擴增DRα和DRβ的信號肽及胞外序列,運用重疊PCR將DRα和DRβ片段分彆與Fos和Jun的亮氨痠拉鏈序列相連,成為DRα-Fos和DRβ-Jun,DRα和DRβ可憑藉Fos和Jun的亮氨痠拉鏈結閤形成DR1分子,再通過EcoR Ⅰ酶切位點將DRα-Fos和人IgG1的Fc段相連,形成DRα-Fos-Fc重組序列,2箇同源的DR1分子可通過IgG1的Fc段的二硫鍵結閤形成二聚體.分彆將DRα-Fos-Fc及DRβ-Jun插入桿狀病毒錶達載體pFastBacTMDual的2箇多剋隆位點處,構建齣重組載體pFast BacTMDual+[DR1/Fc].對構建的載體進行PCR及限製性內切酶酶切鑒定和測序.採用脂質體轉染方法將錶達載體轉入昆蟲細胞繫Sf9中,通過雙抗夾心ELISA及Western blot檢測HLA-DR1的錶達.結果 PCR及酶切鑒定和測序證實目的基因插入正確且序列與GenBank一緻.ELISA和Western blot檢測錶明DR1桿狀病毒感染的Sf9細胞培養上清HLA-DR1錶達呈暘性,且錶達的HLA-DR1分子具有正確的構象.結論 成功構建齣桿狀病毒錶達載體pFastBacTMDual+[DR1/Fc],併在Sf9細胞中得到錶達,為研究HLA-DR1限製性的T細胞應答奠定瞭基礎.
목적 구건 HLA-DR1(유DRA화 DRB1*01 기인편마)간상병독표체재체,병사기재곤충세포내득도표체.방법 채용RT-PCR방법종721.221세포중확증DRα화DRβ적신호태급포외서렬,운용중첩PCR장DRα화DRβ편단분별여Fos화Jun적량안산랍련서렬상련,성위DRα-Fos화DRβ-Jun,DRα화DRβ가빙차Fos화Jun적량안산랍련결합형성DR1분자,재통과EcoR Ⅰ매절위점장DRα-Fos화인IgG1적Fc단상련,형성DRα-Fos-Fc중조서렬,2개동원적DR1분자가통과IgG1적Fc단적이류건결합형성이취체.분별장DRα-Fos-Fc급DRβ-Jun삽입간상병독표체재체pFastBacTMDual적2개다극륭위점처,구건출중조재체pFast BacTMDual+[DR1/Fc].대구건적재체진행PCR급한제성내절매매절감정화측서.채용지질체전염방법장표체재체전입곤충세포계Sf9중,통과쌍항협심ELISA급Western blot검측HLA-DR1적표체.결과 PCR급매절감정화측서증실목적기인삽입정학차서렬여GenBank일치.ELISA화Western blot검측표명DR1간상병독감염적Sf9세포배양상청HLA-DR1표체정양성,차표체적HLA-DR1분자구유정학적구상.결론 성공구건출간상병독표체재체pFastBacTMDual+[DR1/Fc],병재Sf9세포중득도표체,위연구HLA-DR1한제성적T세포응답전정료기출.
