CAJ | 학술논문

本研究用基因工程方法构建一种由WT1抗原多表位与结核分枝杆菌热休克蛋白70(mHSP70)刺激表位组成的融合基因疫苗并检测其表达和病疫原性.根据文献资料,筛选WT1抗原有良好免疫原性的3个受HLA0201与1个受HLA2402限制性的细胞毒性T细胞(CTL)表位及2个辅助性T细胞(Th)表位,加入通用外源性T细胞刺激表位Pan-DR-Th(PADRE)后,以不同的间隔序列相连,蛋白酶体切割软件优化多表位构成,合成1条由732 bp组成的多表位WT1基因片段,并插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)中.通过PCR技术从结核分支杆菌基因组(mycobacterium tuberculosis heat shock protein 70,mHSP70)中扩增包含mHSP70刺激表位的DNA片段,亚克隆至pcDNA3.1(+),测序正确后将含有多表位的WT1基因片段亚克隆入该载体上游,构建融合基因疫苗pcDNA3.1-WT1-mHSP70(407-426).用RT-PCR方法检测该基因在293T细胞表达,并免疫C57BL/6小鼠,酶联免疫吸附斑点法(ELISPOT)检测该疫苗的细胞免疫学反应.结果表明:通过蛋白酶体切割工具PAPROC及NETCHOP3.1预测,复合多表位基因工程疫苗各表位可被正确裂解,PCR和酶切鉴定结果表明,构建的重组真核表达质粒pcDNA3.1-WT1-mHSP70(407-426)含有正确编码的融合基因片段,并在真核细胞获得了正确表达.将该基因疫苗免疫小鼠后,可诱导特异性的CTL应答.结论:成功构建含有WT1多表位与热休克蛋白70刺激表位融合基因疫苗.
본연구용기인공정방법구건일충유WT1항원다표위여결핵분지간균열휴극단백70(mHSP70)자격표위조성적융합기인역묘병검측기표체화병역원성.근거문헌자료,사선WT1항원유량호면역원성적3개수HLA0201여1개수HLA2402한제성적세포독성T세포(CTL)표위급2개보조성T세포(Th)표위,가입통용외원성T세포자격표위Pan-DR-Th(PADRE)후,이불동적간격서렬상련,단백매체절할연건우화다표위구성,합성1조유732 bp조성적다표위WT1기인편단,병삽입진핵표체질립pcDNA3.1(+)중.통과PCR기술종결핵분지간균기인조(mycobacterium tuberculosis heat shock protein 70,mHSP70)중확증포함mHSP70자격표위적DNA편단,아극륭지pcDNA3.1(+),측서정학후장함유다표위적WT1기인편단아극륭입해재체상유,구건융합기인역묘pcDNA3.1-WT1-mHSP70(407-426).용RT-PCR방법검측해기인재293T세포표체,병면역C57BL/6소서,매련면역흡부반점법(ELISPOT)검측해역묘적세포면역학반응.결과표명:통과단백매체절할공구PAPROC급NETCHOP3.1예측,복합다표위기인공정역묘각표위가피정학렬해,PCR화매절감정결과표명,구건적중조진핵표체질립pcDNA3.1-WT1-mHSP70(407-426)함유정학편마적융합기인편단,병재진핵세포획득료정학표체.장해기인역묘면역소서후,가유도특이성적CTL응답.결론:성공구건함유WT1다표위여열휴극단백70자격표위융합기인역묘.