浙江大学学报（医学版）
浙江大學學報（醫學版）
절강대학학보（의학판）
JOURNAL OF ZHEJIANG UNIVERSITY MEDICAL SCIENCES
2006年
2期
154-160
,共7页
潘修成%陈智%倪勤%羊正纲%徐宁%金晗英
潘脩成%陳智%倪勤%羊正綱%徐寧%金晗英
반수성%진지%예근%양정강%서저%금함영
肝炎病毒,乙型%基因%shRNA表达框%小干扰RNA%筛选%HBV C基因
肝炎病毒,乙型%基因%shRNA錶達框%小榦擾RNA%篩選%HBV C基因
간염병독,을형%기인%shRNA표체광%소간우RNA%사선%HBV C기인
目的:以tRNAva1-shRNA表达框技术筛选高效的HBV C基因siRNA靶位.方法:针对HBV C基因序列设定5个siRNA靶位,以一步重叠延伸PCR技术生成含tRNAva1启动子的shRNA表达框(SEC),分别与HBV C基因与EGFP融合表达质粒(pC-EGFP)共转染AD293细胞,转染后48 h,流式细胞术检测融合基因荧光表达情况,半定量RT-PCR法检测HBV-C基因mRNA表达水平.以筛选的shRNA表达框转染hepG2.2.15细胞,72 h后放免法检测细胞培养上清HbsAg、HbeAg水平,RT-PCR检测细胞HBV pgRNA水平.结果:共转染shRNA表达框能有效抑制融合表达质粒(pC-GFP)荧光强度和HBV C mRNA表达,其中SEC-492i抑制效率最佳,而SEC-282i相对较差.选定的492i表达框(SEC-492i)及282ishRNA表达框(SEC-282i),均呈剂量依赖性抑制hepG2.2.15细胞HbeAg分泌和HBV pgRNA水平,其中SEC-492i抑制HbeAg和HBV pgRNA水平明显优于SEC-282i.结论:在选定的5个siRNA靶位中,以492i靶位RNAi效率最高.tRNAval_shRNA表达框技术可用于抗HBV高效siRNA靶位的筛选,有进一步推广应用价值.
目的:以tRNAva1-shRNA錶達框技術篩選高效的HBV C基因siRNA靶位.方法:針對HBV C基因序列設定5箇siRNA靶位,以一步重疊延伸PCR技術生成含tRNAva1啟動子的shRNA錶達框(SEC),分彆與HBV C基因與EGFP融閤錶達質粒(pC-EGFP)共轉染AD293細胞,轉染後48 h,流式細胞術檢測融閤基因熒光錶達情況,半定量RT-PCR法檢測HBV-C基因mRNA錶達水平.以篩選的shRNA錶達框轉染hepG2.2.15細胞,72 h後放免法檢測細胞培養上清HbsAg、HbeAg水平,RT-PCR檢測細胞HBV pgRNA水平.結果:共轉染shRNA錶達框能有效抑製融閤錶達質粒(pC-GFP)熒光彊度和HBV C mRNA錶達,其中SEC-492i抑製效率最佳,而SEC-282i相對較差.選定的492i錶達框(SEC-492i)及282ishRNA錶達框(SEC-282i),均呈劑量依賴性抑製hepG2.2.15細胞HbeAg分泌和HBV pgRNA水平,其中SEC-492i抑製HbeAg和HBV pgRNA水平明顯優于SEC-282i.結論:在選定的5箇siRNA靶位中,以492i靶位RNAi效率最高.tRNAval_shRNA錶達框技術可用于抗HBV高效siRNA靶位的篩選,有進一步推廣應用價值.
목적:이tRNAva1-shRNA표체광기술사선고효적HBV C기인siRNA파위.방법:침대HBV C기인서렬설정5개siRNA파위,이일보중첩연신PCR기술생성함tRNAva1계동자적shRNA표체광(SEC),분별여HBV C기인여EGFP융합표체질립(pC-EGFP)공전염AD293세포,전염후48 h,류식세포술검측융합기인형광표체정황,반정량RT-PCR법검측HBV-C기인mRNA표체수평.이사선적shRNA표체광전염hepG2.2.15세포,72 h후방면법검측세포배양상청HbsAg、HbeAg수평,RT-PCR검측세포HBV pgRNA수평.결과:공전염shRNA표체광능유효억제융합표체질립(pC-GFP)형광강도화HBV C mRNA표체,기중SEC-492i억제효솔최가,이SEC-282i상대교차.선정적492i표체광(SEC-492i)급282ishRNA표체광(SEC-282i),균정제량의뢰성억제hepG2.2.15세포HbeAg분비화HBV pgRNA수평,기중SEC-492i억제HbeAg화HBV pgRNA수평명현우우SEC-282i.결론:재선정적5개siRNA파위중,이492i파위RNAi효솔최고.tRNAval_shRNA표체광기술가용우항HBV고효siRNA파위적사선,유진일보추엄응용개치.
