目的:利用过氧化氢作为外源性活性氧来源,探讨氧化应激对C2C12成肌细胞增殖与凋亡的影响.方法:实验于2005-10/2006-01在广东省组织构建与检测重点实验室完成.C2C12成肌细胞(美国ATCC,批号CRL-1722TM);过氧化氢(汕头市光华化学药厂,批号20050519).①C2C12细胞置于含100 mg/L青霉素,100 mg/L链霉素和体积分数为0.1胎牛血清的DMEM-F12培养基中常规培养.②采用四甲基偶氮唑盐法测定过氧化氢对C2C12细胞增殖的影响.取体外培养的C2C12细胞,胰酶消化后制成单细胞悬液,离心重悬,血细胞计数板进行细胞计数,细胞悬液密度为3.4×106 L-1,接种至96孔板,200 μL/孔.实验共分5组:过氧化氢25,50,100,300 μmol/L浓度组、空白对照组,6个平行孔/组.各组在37℃、体积分数为0.05的CO2细胞培养箱内常规培养.待细胞融合率达80%且未出现细胞分化时,过氧化氢各浓度组分别向C2C12细胞中加入含对应浓度过氧化氢的无血清培养基,空白对照组则向C2C12细胞中加入单纯无血清培养基.各组细胞分别于过氧化氢处理0,6,12,24,36,48,60 h后,每孔加入2 g/L的四甲基偶氮唑盐液20μL,于酶联免疫仪570 nm处检测各孔吸光度值.③过氧化氢对C2C12细胞凋亡的影响:采用Hoechst 33342/PI双染检测C2C12细胞凋亡.正常细胞核Hoechst着色为淡蓝色,形态呈圆形,内有较深的蓝色颗粒;中早期凋亡细胞核Hoechst着色呈亮蓝色,或核呈分叶,碎片状,边集;坏死或晚期凋亡的细胞核PI着红色,Hoechst因细胞膜破裂而不能着色.取体外培养的C2C12细胞,制备单细胞悬液过程同上,按1.8X107 L-1密度接种至6孔板,5 mL/孔.实验分组及干预措施同上,3个平行孔/组.处理36 h后立即进行Hoechst33342/PI凋亡双染,荧光倒置显微镜下观察,各组随机取6个不同视野进行细胞计数,计数实验重复3次,取平均值作为细胞凋亡率.结果:①过氧化氢对C2C12细胞增殖的影响:细胞处理36 h后与空白对照组比较,过氧化氢25μmol/L浓度组平均吸光度值与之相近(0.207±0.014,0.199±0.023;t=0.677,P＞0.05),即促进C2C12细胞增殖;过氧化氢50,100,300μmol/L浓度组平均吸光度值均显著下降(0.182±0.027,0.149±0.009,0.052±0.012;t=1.990,8.251,20.004,P均＜0.05),即抑制C2C12细胞增殖,且呈时效和量效关系.②过氧化氢对C2C12细胞凋亡的影响:细胞处理36 h后,与空白对照组比较,过氧化氢25 μmol/L浓度组细胞凋亡率明显降低[(9.09±0.85)%,(4.61±0.67)%;t=22.95,P＜0.01];过氧化氢50,100,300 μmol/L浓度组细胞凋亡率则明显提高[(33.50±5.74)%,(45.95±6.82)%,(76.47±4.66)%;t=4.35,4.68,18.02,P均＜0.01],且呈时效和量效关系.结论:活性氧在C2C12成肌细胞增殖与凋亡过程中扮演重要角色,低浓度可促进C2C12细胞增殖,高浓度则能够抑制其增殖并促进凋亡,且呈时效和量效关系.提示氧化应激对成肌细胞的生长具有调节作用.
目的:利用過氧化氫作為外源性活性氧來源,探討氧化應激對C2C12成肌細胞增殖與凋亡的影響.方法:實驗于2005-10/2006-01在廣東省組織構建與檢測重點實驗室完成.C2C12成肌細胞(美國ATCC,批號CRL-1722TM);過氧化氫(汕頭市光華化學藥廠,批號20050519).①C2C12細胞置于含100 mg/L青黴素,100 mg/L鏈黴素和體積分數為0.1胎牛血清的DMEM-F12培養基中常規培養.②採用四甲基偶氮唑鹽法測定過氧化氫對C2C12細胞增殖的影響.取體外培養的C2C12細胞,胰酶消化後製成單細胞懸液,離心重懸,血細胞計數闆進行細胞計數,細胞懸液密度為3.4×106 L-1,接種至96孔闆,200 μL/孔.實驗共分5組:過氧化氫25,50,100,300 μmol/L濃度組、空白對照組,6箇平行孔/組.各組在37℃、體積分數為0.05的CO2細胞培養箱內常規培養.待細胞融閤率達80%且未齣現細胞分化時,過氧化氫各濃度組分彆嚮C2C12細胞中加入含對應濃度過氧化氫的無血清培養基,空白對照組則嚮C2C12細胞中加入單純無血清培養基.各組細胞分彆于過氧化氫處理0,6,12,24,36,48,60 h後,每孔加入2 g/L的四甲基偶氮唑鹽液20μL,于酶聯免疫儀570 nm處檢測各孔吸光度值.③過氧化氫對C2C12細胞凋亡的影響:採用Hoechst 33342/PI雙染檢測C2C12細胞凋亡.正常細胞覈Hoechst著色為淡藍色,形態呈圓形,內有較深的藍色顆粒;中早期凋亡細胞覈Hoechst著色呈亮藍色,或覈呈分葉,碎片狀,邊集;壞死或晚期凋亡的細胞覈PI著紅色,Hoechst因細胞膜破裂而不能著色.取體外培養的C2C12細胞,製備單細胞懸液過程同上,按1.8X107 L-1密度接種至6孔闆,5 mL/孔.實驗分組及榦預措施同上,3箇平行孔/組.處理36 h後立即進行Hoechst33342/PI凋亡雙染,熒光倒置顯微鏡下觀察,各組隨機取6箇不同視野進行細胞計數,計數實驗重複3次,取平均值作為細胞凋亡率.結果:①過氧化氫對C2C12細胞增殖的影響:細胞處理36 h後與空白對照組比較,過氧化氫25μmol/L濃度組平均吸光度值與之相近(0.207±0.014,0.199±0.023;t=0.677,P＞0.05),即促進C2C12細胞增殖;過氧化氫50,100,300μmol/L濃度組平均吸光度值均顯著下降(0.182±0.027,0.149±0.009,0.052±0.012;t=1.990,8.251,20.004,P均＜0.05),即抑製C2C12細胞增殖,且呈時效和量效關繫.②過氧化氫對C2C12細胞凋亡的影響:細胞處理36 h後,與空白對照組比較,過氧化氫25 μmol/L濃度組細胞凋亡率明顯降低[(9.09±0.85)%,(4.61±0.67)%;t=22.95,P＜0.01];過氧化氫50,100,300 μmol/L濃度組細胞凋亡率則明顯提高[(33.50±5.74)%,(45.95±6.82)%,(76.47±4.66)%;t=4.35,4.68,18.02,P均＜0.01],且呈時效和量效關繫.結論:活性氧在C2C12成肌細胞增殖與凋亡過程中扮縯重要角色,低濃度可促進C2C12細胞增殖,高濃度則能夠抑製其增殖併促進凋亡,且呈時效和量效關繫.提示氧化應激對成肌細胞的生長具有調節作用.
목적:이용과양화경작위외원성활성양래원,탐토양화응격대C2C12성기세포증식여조망적영향.방법:실험우2005-10/2006-01재광동성조직구건여검측중점실험실완성.C2C12성기세포(미국ATCC,비호CRL-1722TM);과양화경(산두시광화화학약엄,비호20050519).①C2C12세포치우함100 mg/L청매소,100 mg/L련매소화체적분수위0.1태우혈청적DMEM-F12배양기중상규배양.②채용사갑기우담서염법측정과양화경대C2C12세포증식적영향.취체외배양적C2C12세포,이매소화후제성단세포현액,리심중현,혈세포계수판진행세포계수,세포현액밀도위3.4×106 L-1,접충지96공판,200 μL/공.실험공분5조:과양화경25,50,100,300 μmol/L농도조、공백대조조,6개평행공/조.각조재37℃、체적분수위0.05적CO2세포배양상내상규배양.대세포융합솔체80%차미출현세포분화시,과양화경각농도조분별향C2C12세포중가입함대응농도과양화경적무혈청배양기,공백대조조칙향C2C12세포중가입단순무혈청배양기.각조세포분별우과양화경처리0,6,12,24,36,48,60 h후,매공가입2 g/L적사갑기우담서염액20μL,우매련면역의570 nm처검측각공흡광도치.③과양화경대C2C12세포조망적영향:채용Hoechst 33342/PI쌍염검측C2C12세포조망.정상세포핵Hoechst착색위담람색,형태정원형,내유교심적람색과립;중조기조망세포핵Hoechst착색정량람색,혹핵정분협,쇄편상,변집;배사혹만기조망적세포핵PI착홍색,Hoechst인세포막파렬이불능착색.취체외배양적C2C12세포,제비단세포현액과정동상,안1.8X107 L-1밀도접충지6공판,5 mL/공.실험분조급간예조시동상,3개평행공/조.처리36 h후립즉진행Hoechst33342/PI조망쌍염,형광도치현미경하관찰,각조수궤취6개불동시야진행세포계수,계수실험중복3차,취평균치작위세포조망솔.결과:①과양화경대C2C12세포증식적영향:세포처리36 h후여공백대조조비교,과양화경25μmol/L농도조평균흡광도치여지상근(0.207±0.014,0.199±0.023;t=0.677,P＞0.05),즉촉진C2C12세포증식;과양화경50,100,300μmol/L농도조평균흡광도치균현저하강(0.182±0.027,0.149±0.009,0.052±0.012;t=1.990,8.251,20.004,P균＜0.05),즉억제C2C12세포증식,차정시효화량효관계.②과양화경대C2C12세포조망적영향:세포처리36 h후,여공백대조조비교,과양화경25 μmol/L농도조세포조망솔명현강저[(9.09±0.85)%,(4.61±0.67)%;t=22.95,P＜0.01];과양화경50,100,300 μmol/L농도조세포조망솔칙명현제고[(33.50±5.74)%,(45.95±6.82)%,(76.47±4.66)%;t=4.35,4.68,18.02,P균＜0.01],차정시효화량효관계.결론:활성양재C2C12성기세포증식여조망과정중분연중요각색,저농도가촉진C2C12세포증식,고농도칙능구억제기증식병촉진조망,차정시효화량효관계.제시양화응격대성기세포적생장구유조절작용.
