解剖学报
解剖學報
해부학보
ACTA ANATOMICA SINICA
2002年
2期
157-160
,共4页
陈立南%孙成三%陈晴%段德义%杨慧%张进禄%徐群渊
陳立南%孫成三%陳晴%段德義%楊慧%張進祿%徐群淵
진립남%손성삼%진청%단덕의%양혜%장진록%서군연
蛋白纯化%真核表达%受体%表位标记%胶质细胞源性神经营养因子%受体酪氨酸激酶
蛋白純化%真覈錶達%受體%錶位標記%膠質細胞源性神經營養因子%受體酪氨痠激酶
단백순화%진핵표체%수체%표위표기%효질세포원성신경영양인자%수체락안산격매
目的用DNA重组方法去除胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)受体(GFRα-1)基因3'-端的与细胞膜糖基化磷脂酰肌醇(GPI)相连的信号序列,使表达的GFRα-1以可溶性形式介导GDNF的作用.方法设计-对引物,其中下游引物含有6个组氨酸密码子序列,以人GFRα-1全长cDNA为模板,PCR扩增编码可溶性GFRα-1序列并亚克隆于pBK-RSV真核表达载体,转染COS-7细胞,收获培养上清,进行SDS-PAGE及Western免疫印迹分析;使用钴离子金属螯合层析柱进行纯化;检测RET酪氨酸磷酸化以鉴定其生物学活性. 结果Westem免疫印迹证实培养上清液中有分子量为60kD的特异阳性条带,与糖基化的GFRα-1分子量相符;金属螯合层析得到纯度达90%以上的重组GFRα-1蛋白,每ml COS-7培养上清中含有0.5μg. 结论带6个组氨酸尾的重组可溶性GFRα-1能够介导GDNF的作用,可引发酪氨酸激酶RET的磷酸化.
目的用DNA重組方法去除膠質細胞源性神經營養因子(GDNF)受體(GFRα-1)基因3'-耑的與細胞膜糖基化燐脂酰肌醇(GPI)相連的信號序列,使錶達的GFRα-1以可溶性形式介導GDNF的作用.方法設計-對引物,其中下遊引物含有6箇組氨痠密碼子序列,以人GFRα-1全長cDNA為模闆,PCR擴增編碼可溶性GFRα-1序列併亞剋隆于pBK-RSV真覈錶達載體,轉染COS-7細胞,收穫培養上清,進行SDS-PAGE及Western免疫印跡分析;使用鈷離子金屬螯閤層析柱進行純化;檢測RET酪氨痠燐痠化以鑒定其生物學活性. 結果Westem免疫印跡證實培養上清液中有分子量為60kD的特異暘性條帶,與糖基化的GFRα-1分子量相符;金屬螯閤層析得到純度達90%以上的重組GFRα-1蛋白,每ml COS-7培養上清中含有0.5μg. 結論帶6箇組氨痠尾的重組可溶性GFRα-1能夠介導GDNF的作用,可引髮酪氨痠激酶RET的燐痠化.
목적용DNA중조방법거제효질세포원성신경영양인자(GDNF)수체(GFRα-1)기인3'-단적여세포막당기화린지선기순(GPI)상련적신호서렬,사표체적GFRα-1이가용성형식개도GDNF적작용.방법설계-대인물,기중하유인물함유6개조안산밀마자서렬,이인GFRα-1전장cDNA위모판,PCR확증편마가용성GFRα-1서렬병아극륭우pBK-RSV진핵표체재체,전염COS-7세포,수획배양상청,진행SDS-PAGE급Western면역인적분석;사용고리자금속오합층석주진행순화;검측RET락안산린산화이감정기생물학활성. 결과Westem면역인적증실배양상청액중유분자량위60kD적특이양성조대,여당기화적GFRα-1분자량상부;금속오합층석득도순도체90%이상적중조GFRα-1단백,매ml COS-7배양상청중함유0.5μg. 결론대6개조안산미적중조가용성GFRα-1능구개도GDNF적작용,가인발락안산격매RET적린산화.
