畜牧兽医学报
畜牧獸醫學報
축목수의학보
2010年
12期
1636-1641
,共6页
辛晓玲%吕长荣%陈冬梅%窦忠英
辛曉玲%呂長榮%陳鼕梅%竇忠英
신효령%려장영%진동매%두충영
牛%Klf4基因%iPS细胞%反转录病毒载体
牛%Klf4基因%iPS細胞%反轉錄病毒載體
우%Klf4기인%iPS세포%반전록병독재체
为了克隆牛Klf4基因并构建重组反转录病毒载体,得到稳定的产毒细胞株,本研究设计了带有酶切位点的一对引物,以接触抑制生长状态的MDBK细胞为材料,用RT-PCR方法克隆出牛Klf4基因的开放阅读框序列,将之插入干细胞反转录病毒载体pMSCVneo构成真核表达载体pMSCV-Klf4;采用脂质体法将pMSCV-Klf4转染包装细胞PT67,通过G418筛选得到稳定的产毒细胞株,电镜观察培养液上清中的病毒颗粒,同时病毒感染NIH3T3细胞测定其病毒滴度.结果表明,本研究克隆的牛Klf4基因开放阅读框序列与已发表序列(NM-001105385)比对有99.9%的高同源性;构建的重组载体质粒可正常包装,电镜下可观察到典型的病毒颗粒,筛选出的产毒细胞株病毒滴度达7.16×107 CFU·mL-1.本研究成功构建的真核表达载体pMSCV-Klf4和得到的产毒细胞株,为进一步开展有关牛iPS细胞的研究奠定了基础.
為瞭剋隆牛Klf4基因併構建重組反轉錄病毒載體,得到穩定的產毒細胞株,本研究設計瞭帶有酶切位點的一對引物,以接觸抑製生長狀態的MDBK細胞為材料,用RT-PCR方法剋隆齣牛Klf4基因的開放閱讀框序列,將之插入榦細胞反轉錄病毒載體pMSCVneo構成真覈錶達載體pMSCV-Klf4;採用脂質體法將pMSCV-Klf4轉染包裝細胞PT67,通過G418篩選得到穩定的產毒細胞株,電鏡觀察培養液上清中的病毒顆粒,同時病毒感染NIH3T3細胞測定其病毒滴度.結果錶明,本研究剋隆的牛Klf4基因開放閱讀框序列與已髮錶序列(NM-001105385)比對有99.9%的高同源性;構建的重組載體質粒可正常包裝,電鏡下可觀察到典型的病毒顆粒,篩選齣的產毒細胞株病毒滴度達7.16×107 CFU·mL-1.本研究成功構建的真覈錶達載體pMSCV-Klf4和得到的產毒細胞株,為進一步開展有關牛iPS細胞的研究奠定瞭基礎.
위료극륭우Klf4기인병구건중조반전록병독재체,득도은정적산독세포주,본연구설계료대유매절위점적일대인물,이접촉억제생장상태적MDBK세포위재료,용RT-PCR방법극륭출우Klf4기인적개방열독광서렬,장지삽입간세포반전록병독재체pMSCVneo구성진핵표체재체pMSCV-Klf4;채용지질체법장pMSCV-Klf4전염포장세포PT67,통과G418사선득도은정적산독세포주,전경관찰배양액상청중적병독과립,동시병독감염NIH3T3세포측정기병독적도.결과표명,본연구극륭적우Klf4기인개방열독광서렬여이발표서렬(NM-001105385)비대유99.9%적고동원성;구건적중조재체질립가정상포장,전경하가관찰도전형적병독과립,사선출적산독세포주병독적도체7.16×107 CFU·mL-1.본연구성공구건적진핵표체재체pMSCV-Klf4화득도적산독세포주,위진일보개전유관우iPS세포적연구전정료기출.
