徐州医学院学报
徐州醫學院學報
서주의학원학보
ACTA ACADEMIAE MEDICINAE XUZHOU
2009年
9期
561-565
,共5页
PSD-95%腺病毒载体%酪氨酸磷酸化
PSD-95%腺病毒載體%酪氨痠燐痠化
PSD-95%선병독재체%락안산린산화
目的 构建PSD-95(postsynaptic density-95)及其突变体PSD-95Y523F和PSD-95Y533F(523和533位酪氨酸分别突变成苯丙氨酸)的复制缺陷型重组腺病毒载体,并检测腺病毒颗粒对体外原代培养皮质神经元的感染能力.方法 双酶切将PSD-95及其突变体的基因分别从载体pcDNA3.1(+) 亚克隆至穿梭载体pAdTrack-CMV中;电穿孔法将穿梭重组体转化到电转感受态细胞BJ5183中,使其与腺病毒骨架载体pAdEasy-1同源重组;同源重组体经PacⅠ酶切线性化,脂质体法转入HEK293H细胞中进行病毒包装;病毒颗粒分别感染HEK293T细胞和原代皮质神经元,荧光检测或免疫印迹方法 检测目的蛋白的表达水平.结果 经酶切电泳鉴定和序列测定证明同源重组体中含序列正确的目的基因;重组腺病毒颗粒感染HEK293T细胞后,免疫印迹显示有较高水平的目的蛋白表达;重组腺病毒具有感染原代皮质神经元的能力,在未成熟神经元(体外培养5～9天)中感染率低,而在成熟神经元(体外培养13天)中感染率较高.结论 成功构建了PSD-95、PSD-95Y523F、PSD-95Y533F的重组腺病毒载体;获得具有感染能力的重组腺病毒颗粒,易于感染成熟的神经元.
目的 構建PSD-95(postsynaptic density-95)及其突變體PSD-95Y523F和PSD-95Y533F(523和533位酪氨痠分彆突變成苯丙氨痠)的複製缺陷型重組腺病毒載體,併檢測腺病毒顆粒對體外原代培養皮質神經元的感染能力.方法 雙酶切將PSD-95及其突變體的基因分彆從載體pcDNA3.1(+) 亞剋隆至穿梭載體pAdTrack-CMV中;電穿孔法將穿梭重組體轉化到電轉感受態細胞BJ5183中,使其與腺病毒骨架載體pAdEasy-1同源重組;同源重組體經PacⅠ酶切線性化,脂質體法轉入HEK293H細胞中進行病毒包裝;病毒顆粒分彆感染HEK293T細胞和原代皮質神經元,熒光檢測或免疫印跡方法 檢測目的蛋白的錶達水平.結果 經酶切電泳鑒定和序列測定證明同源重組體中含序列正確的目的基因;重組腺病毒顆粒感染HEK293T細胞後,免疫印跡顯示有較高水平的目的蛋白錶達;重組腺病毒具有感染原代皮質神經元的能力,在未成熟神經元(體外培養5～9天)中感染率低,而在成熟神經元(體外培養13天)中感染率較高.結論 成功構建瞭PSD-95、PSD-95Y523F、PSD-95Y533F的重組腺病毒載體;穫得具有感染能力的重組腺病毒顆粒,易于感染成熟的神經元.
목적 구건PSD-95(postsynaptic density-95)급기돌변체PSD-95Y523F화PSD-95Y533F(523화533위락안산분별돌변성분병안산)적복제결함형중조선병독재체,병검측선병독과립대체외원대배양피질신경원적감염능력.방법 쌍매절장PSD-95급기돌변체적기인분별종재체pcDNA3.1(+) 아극륭지천사재체pAdTrack-CMV중;전천공법장천사중조체전화도전전감수태세포BJ5183중,사기여선병독골가재체pAdEasy-1동원중조;동원중조체경PacⅠ매절선성화,지질체법전입HEK293H세포중진행병독포장;병독과립분별감염HEK293T세포화원대피질신경원,형광검측혹면역인적방법 검측목적단백적표체수평.결과 경매절전영감정화서렬측정증명동원중조체중함서렬정학적목적기인;중조선병독과립감염HEK293T세포후,면역인적현시유교고수평적목적단백표체;중조선병독구유감염원대피질신경원적능력,재미성숙신경원(체외배양5～9천)중감염솔저,이재성숙신경원(체외배양13천)중감염솔교고.결론 성공구건료PSD-95、PSD-95Y523F、PSD-95Y533F적중조선병독재체;획득구유감염능력적중조선병독과립,역우감염성숙적신경원.
