安徽医科大学学报
安徽醫科大學學報
안휘의과대학학보
ACTA UNIVERSITY MEDICINALIS ANHUI
2010年
6期
733-736
,共4页
目的 构建具有绿色荧光蛋白(GFP)标签的α1抗胰蛋白酶Z突变型(ATZ)的真核表达载体,在人胚胎肾细胞(HEK 293T)中验证表达情况及检测其对细胞的影响.方法以pcDNA3.1-zeo+-ATZ质粒为模版,设计引物,PCR扩增出ATZ的cDNA序列,插入真核表达载体 pEGFP-C1中,构建带有GFP标签的ATZ真核表达载体pEGFP-C1-ATZ,脂质体转染体外培养的HEK 293T细胞,Western blot、荧光显微镜和激光共聚焦显微镜检测GFP-ATZ在细胞中的表达、分布情况及其对细胞形态和分裂的影响.结果 ATZ片段成功插入pEGFP-C1表达质粒,在表达GFP的HEK 293T细胞内,绿色荧光呈弥散的全细胞分布,而表达GFP-ATZ的细胞绿色荧光分布于细胞质内;Western blot结果显示特异性条带,分子量大小与GFP-ATZ预期相符;GFP-ATZ的过度表达引起细胞出现不同程度的形态改变、分裂障碍、聚集体出现甚至死亡.结论 成功构建了具有绿色荧光标记的ATZ真核表达载体,GFP-ATZ的表达具有细胞毒性.
目的 構建具有綠色熒光蛋白(GFP)標籤的α1抗胰蛋白酶Z突變型(ATZ)的真覈錶達載體,在人胚胎腎細胞(HEK 293T)中驗證錶達情況及檢測其對細胞的影響.方法以pcDNA3.1-zeo+-ATZ質粒為模版,設計引物,PCR擴增齣ATZ的cDNA序列,插入真覈錶達載體 pEGFP-C1中,構建帶有GFP標籤的ATZ真覈錶達載體pEGFP-C1-ATZ,脂質體轉染體外培養的HEK 293T細胞,Western blot、熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡檢測GFP-ATZ在細胞中的錶達、分佈情況及其對細胞形態和分裂的影響.結果 ATZ片段成功插入pEGFP-C1錶達質粒,在錶達GFP的HEK 293T細胞內,綠色熒光呈瀰散的全細胞分佈,而錶達GFP-ATZ的細胞綠色熒光分佈于細胞質內;Western blot結果顯示特異性條帶,分子量大小與GFP-ATZ預期相符;GFP-ATZ的過度錶達引起細胞齣現不同程度的形態改變、分裂障礙、聚集體齣現甚至死亡.結論 成功構建瞭具有綠色熒光標記的ATZ真覈錶達載體,GFP-ATZ的錶達具有細胞毒性.
목적 구건구유록색형광단백(GFP)표첨적α1항이단백매Z돌변형(ATZ)적진핵표체재체,재인배태신세포(HEK 293T)중험증표체정황급검측기대세포적영향.방법이pcDNA3.1-zeo+-ATZ질립위모판,설계인물,PCR확증출ATZ적cDNA서렬,삽입진핵표체재체 pEGFP-C1중,구건대유GFP표첨적ATZ진핵표체재체pEGFP-C1-ATZ,지질체전염체외배양적HEK 293T세포,Western blot、형광현미경화격광공취초현미경검측GFP-ATZ재세포중적표체、분포정황급기대세포형태화분렬적영향.결과 ATZ편단성공삽입pEGFP-C1표체질립,재표체GFP적HEK 293T세포내,록색형광정미산적전세포분포,이표체GFP-ATZ적세포록색형광분포우세포질내;Western blot결과현시특이성조대,분자량대소여GFP-ATZ예기상부;GFP-ATZ적과도표체인기세포출현불동정도적형태개변、분렬장애、취집체출현심지사망.결론 성공구건료구유록색형광표기적ATZ진핵표체재체,GFP-ATZ적표체구유세포독성.
