CAJ | 학술논문

通过PCR方法,删除传染性法氏囊病毒HZ2株ORF A1和 ORF A2非重叠区的33 bp (96～129 bp)的同时,引入NheⅠ酶切位点(GcTaGc)作为分子标记,构建含有A节段突变体的真核表达载体pCI-Nhe3,与HZ2株B节段真核表达载体pCI-mB在脂质体介导下共转染鸡胚成纤维(CEF)细胞.用转染细胞的培养液上清不断地接种新鲜细胞,模拟病毒"传代".结果表明,细胞的形态学特征发生变化,产生了类似野生IBDV感染细胞时出现的细胞病变效应(CPE).电子显微镜观察显示,在细胞超薄切片中有IBDV病毒粒子.间接免疫荧光分析结果表明,拯救的ANhe3株病毒的结构蛋白在CEF细胞得到了表达,而非结构蛋白(VP5)则不能表达.针对A节段的RT-PCR,酶切鉴定及进一步的序列测定结果验证了相应核苷酸片段的缺失和分子标记的引入.ANhe3株病毒接种不能导致11日龄SPF鸡胚的死亡,相对HZ2株致死率(20%)明显下降.本研究利用基于cDNA转染和RNA聚合酶Ⅱ系统的IBDV反向遗传系统,构建了IBDV VP5基因大片段缺失的毒株ANhe3株,为IBDV基因组学的研究提供了新方向,为进一步探索病毒复制和致病机制以及开发基因缺失疫苗奠定基础.
통과PCR방법,산제전염성법씨낭병독HZ2주ORF A1화 ORF A2비중첩구적33 bp (96～129 bp)적동시,인입NheⅠ매절위점(GcTaGc)작위분자표기,구건함유A절단돌변체적진핵표체재체pCI-Nhe3,여HZ2주B절단진핵표체재체pCI-mB재지질체개도하공전염계배성섬유(CEF)세포.용전염세포적배양액상청불단지접충신선세포,모의병독"전대".결과표명,세포적형태학특정발생변화,산생료유사야생IBDV감염세포시출현적세포병변효응(CPE).전자현미경관찰현시,재세포초박절편중유IBDV병독입자.간접면역형광분석결과표명,증구적ANhe3주병독적결구단백재CEF세포득도료표체,이비결구단백(VP5)칙불능표체.침대A절단적RT-PCR,매절감정급진일보적서렬측정결과험증료상응핵감산편단적결실화분자표기적인입.ANhe3주병독접충불능도치11일령SPF계배적사망,상대HZ2주치사솔(20%)명현하강.본연구이용기우cDNA전염화RNA취합매Ⅱ계통적IBDV반향유전계통,구건료IBDV VP5기인대편단결실적독주ANhe3주,위IBDV기인조학적연구제공료신방향,위진일보탐색병독복제화치병궤제이급개발기인결실역묘전정기출.