目的:对羊骨髓间充质干细胞加以诱导分化,并与大隐静脉来源的血管间质细胞进行比较,探讨其作为组织工程瓣膜种子细胞的可行性.方法:实验于2006-02/08在西京医院心血管病研究所完成.①家猪10只,屠宰后取主动脉瓣膜,尽量剔去血管外膜,浸入Hank's液中洗涤,制备去细胞主动脉瓣,苏木精-伊红染色比较脱细胞前后的组织特点.②成年杂种绵羊10只,麻醉后分别于股骨大转子穿刺抽取肝素化骨髓10 mL,稀释,离心,弃上清及脂肪层,余细胞用LG-DMEM无血清培养基重悬,铺于等体积的Percoll淋巴细胞分离液上,离心收集单个核细胞,消化传代培养.取第二、三代骨髓间充质干细胞,加入LG-DMEM条件培养基进行体外定向诱导分化.对诱导后细胞进行形态观察、免疫组化鉴定并绘制生长曲线.③上述10只绵羊抽取骨髓后,无菌条件下取大隐静脉,剥去静脉外膜,剪成1 mm3贴壁法培养,消化传代.④取第3代骨髓间充质干细胞与血管间质细胞,分别以5×104L-1密度接种于24孔培养板,常规孵育96 h.每孔各吸取培养基0.5 mL,测定两种细胞上清液中的羟脯氨酸含量.完毕后用胰蛋白酶消化处于对数生长期的细胞,加入冻存液,调整细胞密度为7x109L-1,置于液氮中,1周后复苏,计算两种细胞的存活率.⑤将去细胞猪主动脉瓣修剪成0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm大小,骨髓间充质干细胞、血管间质细胞均按105/cm2密度接种,置入37℃、体积分数为0.05的C02孵箱中.反复种植3次,每次间隔24 h,第4天各组均取出2份样本,扫描电镜观察.第7天向其余标本中加入四唑盐,采用酶联免疫检测仪490 nm处骨髓间充质干细胞组、血管间质细胞组的吸光度值,比较两种细结果:①新鲜的猪瓣叶中含有大量的成纤维细胞及内皮细胞.去细胞后,主动脉瓣中未见任何细胞及其碎片成分,纤维网架结构保持完整.②传代培养后的骨髓间充质干细胞和血管间质细胞形态相似,呈梭形或多角型,均于24 h内贴壁,3-4 d铺满瓶底;两种细胞对平滑肌肌动蛋白α、波形蛋白均呈部分阳性表达;且生长曲线相似,倍增时间分别为38 h和36 h(P＞0.05).③诱导分化后的骨髓间充质干细胞与血管间质细胞上清液羟脯氨酸含量基本相似[(1.52±0.21),(1.43±0.20)mg/L,P＞0.05].冻存复苏后,两种细胞的存活率亦基本相似[(85±3)%,(87±4)%,P＞0.05].④诱导分化后的骨髓间充质干细胞与血管间质细胞均能够种植在去细胞猪主动脉瓣上,两种细胞的吸光度值基本相似(0.50±0.04,0.48±0.03,P＞0.05).结论:诱导分化的骨髓间充质干细胞能够黏附在去细胞猪主动脉瓣膜支架上贴壁生长,与静脉来源的血管间质细胞在存活率、复苏后生长增殖情况、合成胶原功能等方面无明显差别,是合适的组织工程瓣膜间质种子细胞.
目的:對羊骨髓間充質榦細胞加以誘導分化,併與大隱靜脈來源的血管間質細胞進行比較,探討其作為組織工程瓣膜種子細胞的可行性.方法:實驗于2006-02/08在西京醫院心血管病研究所完成.①傢豬10隻,屠宰後取主動脈瓣膜,儘量剔去血管外膜,浸入Hank's液中洗滌,製備去細胞主動脈瓣,囌木精-伊紅染色比較脫細胞前後的組織特點.②成年雜種綿羊10隻,痳醉後分彆于股骨大轉子穿刺抽取肝素化骨髓10 mL,稀釋,離心,棄上清及脂肪層,餘細胞用LG-DMEM無血清培養基重懸,鋪于等體積的Percoll淋巴細胞分離液上,離心收集單箇覈細胞,消化傳代培養.取第二、三代骨髓間充質榦細胞,加入LG-DMEM條件培養基進行體外定嚮誘導分化.對誘導後細胞進行形態觀察、免疫組化鑒定併繪製生長麯線.③上述10隻綿羊抽取骨髓後,無菌條件下取大隱靜脈,剝去靜脈外膜,剪成1 mm3貼壁法培養,消化傳代.④取第3代骨髓間充質榦細胞與血管間質細胞,分彆以5×104L-1密度接種于24孔培養闆,常規孵育96 h.每孔各吸取培養基0.5 mL,測定兩種細胞上清液中的羥脯氨痠含量.完畢後用胰蛋白酶消化處于對數生長期的細胞,加入凍存液,調整細胞密度為7x109L-1,置于液氮中,1週後複囌,計算兩種細胞的存活率.⑤將去細胞豬主動脈瓣脩剪成0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm大小,骨髓間充質榦細胞、血管間質細胞均按105/cm2密度接種,置入37℃、體積分數為0.05的C02孵箱中.反複種植3次,每次間隔24 h,第4天各組均取齣2份樣本,掃描電鏡觀察.第7天嚮其餘標本中加入四唑鹽,採用酶聯免疫檢測儀490 nm處骨髓間充質榦細胞組、血管間質細胞組的吸光度值,比較兩種細結果:①新鮮的豬瓣葉中含有大量的成纖維細胞及內皮細胞.去細胞後,主動脈瓣中未見任何細胞及其碎片成分,纖維網架結構保持完整.②傳代培養後的骨髓間充質榦細胞和血管間質細胞形態相似,呈梭形或多角型,均于24 h內貼壁,3-4 d鋪滿瓶底;兩種細胞對平滑肌肌動蛋白α、波形蛋白均呈部分暘性錶達;且生長麯線相似,倍增時間分彆為38 h和36 h(P＞0.05).③誘導分化後的骨髓間充質榦細胞與血管間質細胞上清液羥脯氨痠含量基本相似[(1.52±0.21),(1.43±0.20)mg/L,P＞0.05].凍存複囌後,兩種細胞的存活率亦基本相似[(85±3)%,(87±4)%,P＞0.05].④誘導分化後的骨髓間充質榦細胞與血管間質細胞均能夠種植在去細胞豬主動脈瓣上,兩種細胞的吸光度值基本相似(0.50±0.04,0.48±0.03,P＞0.05).結論:誘導分化的骨髓間充質榦細胞能夠黏附在去細胞豬主動脈瓣膜支架上貼壁生長,與靜脈來源的血管間質細胞在存活率、複囌後生長增殖情況、閤成膠原功能等方麵無明顯差彆,是閤適的組織工程瓣膜間質種子細胞.
목적:대양골수간충질간세포가이유도분화,병여대은정맥래원적혈관간질세포진행비교,탐토기작위조직공정판막충자세포적가행성.방법:실험우2006-02/08재서경의원심혈관병연구소완성.①가저10지,도재후취주동맥판막,진량척거혈관외막,침입Hank's액중세조,제비거세포주동맥판,소목정-이홍염색비교탈세포전후적조직특점.②성년잡충면양10지,마취후분별우고골대전자천자추취간소화골수10 mL,희석,리심,기상청급지방층,여세포용LG-DMEM무혈청배양기중현,포우등체적적Percoll림파세포분리액상,리심수집단개핵세포,소화전대배양.취제이、삼대골수간충질간세포,가입LG-DMEM조건배양기진행체외정향유도분화.대유도후세포진행형태관찰、면역조화감정병회제생장곡선.③상술10지면양추취골수후,무균조건하취대은정맥,박거정맥외막,전성1 mm3첩벽법배양,소화전대.④취제3대골수간충질간세포여혈관간질세포,분별이5×104L-1밀도접충우24공배양판,상규부육96 h.매공각흡취배양기0.5 mL,측정량충세포상청액중적간포안산함량.완필후용이단백매소화처우대수생장기적세포,가입동존액,조정세포밀도위7x109L-1,치우액담중,1주후복소,계산량충세포적존활솔.⑤장거세포저주동맥판수전성0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm대소,골수간충질간세포、혈관간질세포균안105/cm2밀도접충,치입37℃、체적분수위0.05적C02부상중.반복충식3차,매차간격24 h,제4천각조균취출2빈양본,소묘전경관찰.제7천향기여표본중가입사서염,채용매련면역검측의490 nm처골수간충질간세포조、혈관간질세포조적흡광도치,비교량충세결과:①신선적저판협중함유대량적성섬유세포급내피세포.거세포후,주동맥판중미견임하세포급기쇄편성분,섬유망가결구보지완정.②전대배양후적골수간충질간세포화혈관간질세포형태상사,정사형혹다각형,균우24 h내첩벽,3-4 d포만병저;량충세포대평활기기동단백α、파형단백균정부분양성표체;차생장곡선상사,배증시간분별위38 h화36 h(P＞0.05).③유도분화후적골수간충질간세포여혈관간질세포상청액간포안산함량기본상사[(1.52±0.21),(1.43±0.20)mg/L,P＞0.05].동존복소후,량충세포적존활솔역기본상사[(85±3)%,(87±4)%,P＞0.05].④유도분화후적골수간충질간세포여혈관간질세포균능구충식재거세포저주동맥판상,량충세포적흡광도치기본상사(0.50±0.04,0.48±0.03,P＞0.05).결론:유도분화적골수간충질간세포능구점부재거세포저주동맥판막지가상첩벽생장,여정맥래원적혈관간질세포재존활솔、복소후생장증식정황、합성효원공능등방면무명현차별,시합괄적조직공정판막간질충자세포.
