同济大学学报（医学版）
同濟大學學報（醫學版）
동제대학학보（의학판）
JOURNAL OF TONGJI UNIVERSITY (MEDICAL SCIENCE)
2007年
1期
10-14
,共5页
刘树业%俞新大%宋春娟%张健东%石欣荣%张琚
劉樹業%俞新大%宋春娟%張健東%石訢榮%張琚
류수업%유신대%송춘연%장건동%석흔영%장거
肝脏%F抗原%大肠杆菌%基因克隆%蛋白表达%大鼠
肝髒%F抗原%大腸桿菌%基因剋隆%蛋白錶達%大鼠
간장%F항원%대장간균%기인극륭%단백표체%대서
目的 获得大鼠肝脏F蛋白基因克隆(F-protein 's cDNA);利用原核(大肠杆菌)表达系统表达大鼠肝脏F蛋白. 方法提取大鼠肝脏总RNA,对其进行反转录和PCR(RT-PCR)扩增出目的基因(F-protein's cDNA),然后将其与pUCm-T载体进行连接获得克隆质粒pUCm-T- F并转化到大肠杆菌DH5α中;将测序结果正确的克隆片断重新与表达载体pET-15b连接,获得F抗原表达质粒pET15b-F并将其转化到表达菌株BL21(DE3)pLysS中,用1 mmol/L IPTG诱导其表达.结果 RT-PCR扩增出的目的基因(F-protein's cDNA),经测序证明与Gene-bank上提供的F蛋白cDNA序列完全一致;表达后的全菌蛋白进行SDS-PAGE电泳检测,目的蛋白分子量大小约为43 kD,与预期值相符,表达量可达全菌总蛋白量的40%. 结论表达的目的蛋白经His-tag柱进行亲和层析纯化,SDS-PAGE 检测得到了不含其他杂蛋白的单一F蛋白条带,与豚鼠抗人F蛋白抗血清反应成阳性,说明我们经基因工程方法得到的纯化的F蛋白有免疫活性.
目的 穫得大鼠肝髒F蛋白基因剋隆(F-protein 's cDNA);利用原覈(大腸桿菌)錶達繫統錶達大鼠肝髒F蛋白. 方法提取大鼠肝髒總RNA,對其進行反轉錄和PCR(RT-PCR)擴增齣目的基因(F-protein's cDNA),然後將其與pUCm-T載體進行連接穫得剋隆質粒pUCm-T- F併轉化到大腸桿菌DH5α中;將測序結果正確的剋隆片斷重新與錶達載體pET-15b連接,穫得F抗原錶達質粒pET15b-F併將其轉化到錶達菌株BL21(DE3)pLysS中,用1 mmol/L IPTG誘導其錶達.結果 RT-PCR擴增齣的目的基因(F-protein's cDNA),經測序證明與Gene-bank上提供的F蛋白cDNA序列完全一緻;錶達後的全菌蛋白進行SDS-PAGE電泳檢測,目的蛋白分子量大小約為43 kD,與預期值相符,錶達量可達全菌總蛋白量的40%. 結論錶達的目的蛋白經His-tag柱進行親和層析純化,SDS-PAGE 檢測得到瞭不含其他雜蛋白的單一F蛋白條帶,與豚鼠抗人F蛋白抗血清反應成暘性,說明我們經基因工程方法得到的純化的F蛋白有免疫活性.
목적 획득대서간장F단백기인극륭(F-protein 's cDNA);이용원핵(대장간균)표체계통표체대서간장F단백. 방법제취대서간장총RNA,대기진행반전록화PCR(RT-PCR)확증출목적기인(F-protein's cDNA),연후장기여pUCm-T재체진행련접획득극륭질립pUCm-T- F병전화도대장간균DH5α중;장측서결과정학적극륭편단중신여표체재체pET-15b련접,획득F항원표체질립pET15b-F병장기전화도표체균주BL21(DE3)pLysS중,용1 mmol/L IPTG유도기표체.결과 RT-PCR확증출적목적기인(F-protein's cDNA),경측서증명여Gene-bank상제공적F단백cDNA서렬완전일치;표체후적전균단백진행SDS-PAGE전영검측,목적단백분자량대소약위43 kD,여예기치상부,표체량가체전균총단백량적40%. 결론표체적목적단백경His-tag주진행친화층석순화,SDS-PAGE 검측득도료불함기타잡단백적단일F단백조대,여돈서항인F단백항혈청반응성양성,설명아문경기인공정방법득도적순화적F단백유면역활성.
