山东大学基础医学院学报
山東大學基礎醫學院學報
산동대학기출의학원학보
JOURNAL OF PRECLINICAL MEDICINE COLLEGE OF SHANDONG MEDICAL UNIVERSITY
2004年
3期
129-132
,共4页
董平%刘执玉%毕玉顺%田铧%丁兆习
董平%劉執玉%畢玉順%田鏵%丁兆習
동평%류집옥%필옥순%전화%정조습
内皮,血管%内皮生长因子%真核细胞%载体
內皮,血管%內皮生長因子%真覈細胞%載體
내피,혈관%내피생장인자%진핵세포%재체
目的:构建血管内皮生长因子C(VEGF-C)基因的真核表达载体,检测其在真核细胞CHO中的表达.方法:根据人VEGF-C cDNA的序列,设计合成一对特异性引物,用RT-PCR法克隆乳腺癌细胞MCF-7VEGF-C基因的cDNA,回收PCR产物连接于克隆载体.扩增,质粒提取,酶切鉴定并进行基因序列鉴定.酶切回收VEGF-C cDNA全长的基因片段,与真核表达载体pcDNA3.1(-)连接称重组质粒进行酶切鉴定.采用脂质体转染法将构建的pcDNA3.1(-)/VEGF-C转染至CHO细胞中,G418加压筛选培养.最后用Western-blotting法检测细胞培养上清以及裂解细胞中的VEGF-C蛋白.结果:基因测序证实RT-PCR产物包含VEGF-C cDNA全长.重组pcDNA3.1(-)中含有VEGF-C cDNA全长序列,Western-blotting检测到细胞培养上清中以及细胞内有VEGF-C蛋白存在.结论:成功构建了人类VEGF-C真核表达载体并检测到载体在真核细胞中的表达.
目的:構建血管內皮生長因子C(VEGF-C)基因的真覈錶達載體,檢測其在真覈細胞CHO中的錶達.方法:根據人VEGF-C cDNA的序列,設計閤成一對特異性引物,用RT-PCR法剋隆乳腺癌細胞MCF-7VEGF-C基因的cDNA,迴收PCR產物連接于剋隆載體.擴增,質粒提取,酶切鑒定併進行基因序列鑒定.酶切迴收VEGF-C cDNA全長的基因片段,與真覈錶達載體pcDNA3.1(-)連接稱重組質粒進行酶切鑒定.採用脂質體轉染法將構建的pcDNA3.1(-)/VEGF-C轉染至CHO細胞中,G418加壓篩選培養.最後用Western-blotting法檢測細胞培養上清以及裂解細胞中的VEGF-C蛋白.結果:基因測序證實RT-PCR產物包含VEGF-C cDNA全長.重組pcDNA3.1(-)中含有VEGF-C cDNA全長序列,Western-blotting檢測到細胞培養上清中以及細胞內有VEGF-C蛋白存在.結論:成功構建瞭人類VEGF-C真覈錶達載體併檢測到載體在真覈細胞中的錶達.
목적:구건혈관내피생장인자C(VEGF-C)기인적진핵표체재체,검측기재진핵세포CHO중적표체.방법:근거인VEGF-C cDNA적서렬,설계합성일대특이성인물,용RT-PCR법극륭유선암세포MCF-7VEGF-C기인적cDNA,회수PCR산물련접우극륭재체.확증,질립제취,매절감정병진행기인서렬감정.매절회수VEGF-C cDNA전장적기인편단,여진핵표체재체pcDNA3.1(-)련접칭중조질립진행매절감정.채용지질체전염법장구건적pcDNA3.1(-)/VEGF-C전염지CHO세포중,G418가압사선배양.최후용Western-blotting법검측세포배양상청이급렬해세포중적VEGF-C단백.결과:기인측서증실RT-PCR산물포함VEGF-C cDNA전장.중조pcDNA3.1(-)중함유VEGF-C cDNA전장서렬,Western-blotting검측도세포배양상청중이급세포내유VEGF-C단백존재.결론:성공구건료인류VEGF-C진핵표체재체병검측도재체재진핵세포중적표체.
