山东大学学报（医学版）
山東大學學報（醫學版）
산동대학학보（의학판）
JOURNAL OF SHANDONG UNIVERSITY(HEALTH SCIENCES)
2008年
2期
115-118
,共4页
张洪昆%鞠瑛%栾芳%郭春%马春红
張洪昆%鞠瑛%欒芳%郭春%馬春紅
장홍곤%국영%란방%곽춘%마춘홍
基因%Tim-3%人%启动子%Luciferase报告基因
基因%Tim-3%人%啟動子%Luciferase報告基因
기인%Tim-3%인%계동자%Luciferase보고기인
目的 克隆人Tim-3基因5'端非编码区处具有启动子活性的片段,构建其真核报告质粒,为进一步研究Trm3表达调控奠定基础.方法 以人基因组DNA为模板,针对人Ttm-3启动子5'端非编码区处包括翻译起始点ATG和转录起始点TSS在内的-898～+242片段,设计特异性引物,PCR扩增该片段,命名为Tnn-3P2,经双酶切后克隆入pGL3-Basic裁体SacI、XhoI位点,构建pGL3-Tim-3P2荧光素酶报告质粒,与内参照pRL-TK用脂质体法瞬时共转染COS-7、RAW264.7和B16细胞系,通过双荧光素酶活性检测确定其启动子活性.结果 pGL3-Tim-3P2经Ⅸ淑、双酶切及DNA测序分析鉴定正确无误;pGL3-Tim-3P2转染RAW264.7和B16细胞(两种细胞均可表达内源性Tim-3)24h和48h,双荧光素酶活性检测显示其启动子相对活性约为pGL3-Basic空载体的2倍;而pGl3-Tim-3P2转染不表达内源性Tim-3的COS-7细胞后检测不到荧光素酶活性.结论 成功克隆并构建含有人Tim-3启动子的真核报告质粒,该载体具有特异性Tim-3启动子活性,为进一步研究Tim-3表达调控奠定了基础.
目的 剋隆人Tim-3基因5'耑非編碼區處具有啟動子活性的片段,構建其真覈報告質粒,為進一步研究Trm3錶達調控奠定基礎.方法 以人基因組DNA為模闆,針對人Ttm-3啟動子5'耑非編碼區處包括翻譯起始點ATG和轉錄起始點TSS在內的-898～+242片段,設計特異性引物,PCR擴增該片段,命名為Tnn-3P2,經雙酶切後剋隆入pGL3-Basic裁體SacI、XhoI位點,構建pGL3-Tim-3P2熒光素酶報告質粒,與內參照pRL-TK用脂質體法瞬時共轉染COS-7、RAW264.7和B16細胞繫,通過雙熒光素酶活性檢測確定其啟動子活性.結果 pGL3-Tim-3P2經Ⅸ淑、雙酶切及DNA測序分析鑒定正確無誤;pGL3-Tim-3P2轉染RAW264.7和B16細胞(兩種細胞均可錶達內源性Tim-3)24h和48h,雙熒光素酶活性檢測顯示其啟動子相對活性約為pGL3-Basic空載體的2倍;而pGl3-Tim-3P2轉染不錶達內源性Tim-3的COS-7細胞後檢測不到熒光素酶活性.結論 成功剋隆併構建含有人Tim-3啟動子的真覈報告質粒,該載體具有特異性Tim-3啟動子活性,為進一步研究Tim-3錶達調控奠定瞭基礎.
목적 극륭인Tim-3기인5'단비편마구처구유계동자활성적편단,구건기진핵보고질립,위진일보연구Trm3표체조공전정기출.방법 이인기인조DNA위모판,침대인Ttm-3계동자5'단비편마구처포괄번역기시점ATG화전록기시점TSS재내적-898～+242편단,설계특이성인물,PCR확증해편단,명명위Tnn-3P2,경쌍매절후극륭입pGL3-Basic재체SacI、XhoI위점,구건pGL3-Tim-3P2형광소매보고질립,여내삼조pRL-TK용지질체법순시공전염COS-7、RAW264.7화B16세포계,통과쌍형광소매활성검측학정기계동자활성.결과 pGL3-Tim-3P2경Ⅸ숙、쌍매절급DNA측서분석감정정학무오;pGL3-Tim-3P2전염RAW264.7화B16세포(량충세포균가표체내원성Tim-3)24h화48h,쌍형광소매활성검측현시기계동자상대활성약위pGL3-Basic공재체적2배;이pGl3-Tim-3P2전염불표체내원성Tim-3적COS-7세포후검측불도형광소매활성.결론 성공극륭병구건함유인Tim-3계동자적진핵보고질립,해재체구유특이성Tim-3계동자활성,위진일보연구Tim-3표체조공전정료기출.
