高技术通讯
高技術通訊
고기술통신
HIGH TECHNOLOGY LETTERS
2009年
1期
99-104
,共6页
狄静芳%贺进田%徐瑞光%陈希%赵宝华
狄靜芳%賀進田%徐瑞光%陳希%趙寶華
적정방%하진전%서서광%진희%조보화
葡激酶%Arg-Gly-Asp(RGD)%抗血小板聚集
葡激酶%Arg-Gly-Asp(RGD)%抗血小闆聚集
포격매%Arg-Gly-Asp(RGD)%항혈소판취집
为解决葡激酶存在的溶栓后再栓塞问题,利用PCR介导的定点突变技术,在野生型葡激酶(wt-SAK)N-末端的第3、4位氨基酸之间插入Arg-Gly-Asp(RGD)序列构建了葡激酶突变体MD2-SAK,另将N-末端的前3位氨基酸替换为RGD序列构建了葡激酶突变体MD4-SAK.将突变体基因分别连接表达载体pBV220,转化大肠杆菌DH5α,经过热激诱导后,突变体均以可溶性形式得到高效表达,表达蛋白占菌体总蛋白的50%以上.破菌上清液通过SP-Sepharose FF、Sephadex G-50和Q-Sepharose FF三步连续的色谱层析纯化得到纤溶活性分别为10.1×104 AU/mg、11.2×104 AU/mg,纯度均大于96%的突变体蛋白.进一步研究了突变体的性质,结果表明葡激酶突变体不仅保留了野生型葡激酶的纤溶酶原激活活性,并具有较强的抗血小板聚集活性.同时发现,葡激酶突变体的N-末端序列会影响其N-末端甲硫氨酸的酶切加工.
為解決葡激酶存在的溶栓後再栓塞問題,利用PCR介導的定點突變技術,在野生型葡激酶(wt-SAK)N-末耑的第3、4位氨基痠之間插入Arg-Gly-Asp(RGD)序列構建瞭葡激酶突變體MD2-SAK,另將N-末耑的前3位氨基痠替換為RGD序列構建瞭葡激酶突變體MD4-SAK.將突變體基因分彆連接錶達載體pBV220,轉化大腸桿菌DH5α,經過熱激誘導後,突變體均以可溶性形式得到高效錶達,錶達蛋白佔菌體總蛋白的50%以上.破菌上清液通過SP-Sepharose FF、Sephadex G-50和Q-Sepharose FF三步連續的色譜層析純化得到纖溶活性分彆為10.1×104 AU/mg、11.2×104 AU/mg,純度均大于96%的突變體蛋白.進一步研究瞭突變體的性質,結果錶明葡激酶突變體不僅保留瞭野生型葡激酶的纖溶酶原激活活性,併具有較彊的抗血小闆聚集活性.同時髮現,葡激酶突變體的N-末耑序列會影響其N-末耑甲硫氨痠的酶切加工.
위해결포격매존재적용전후재전새문제,이용PCR개도적정점돌변기술,재야생형포격매(wt-SAK)N-말단적제3、4위안기산지간삽입Arg-Gly-Asp(RGD)서렬구건료포격매돌변체MD2-SAK,령장N-말단적전3위안기산체환위RGD서렬구건료포격매돌변체MD4-SAK.장돌변체기인분별련접표체재체pBV220,전화대장간균DH5α,경과열격유도후,돌변체균이가용성형식득도고효표체,표체단백점균체총단백적50%이상.파균상청액통과SP-Sepharose FF、Sephadex G-50화Q-Sepharose FF삼보련속적색보층석순화득도섬용활성분별위10.1×104 AU/mg、11.2×104 AU/mg,순도균대우96%적돌변체단백.진일보연구료돌변체적성질,결과표명포격매돌변체불부보류료야생형포격매적섬용매원격활활성,병구유교강적항혈소판취집활성.동시발현,포격매돌변체적N-말단서렬회영향기N-말단갑류안산적매절가공.
