分子细胞生物学报
分子細胞生物學報
분자세포생물학보
JOURNAL OF MOLECULAR CELL BIOLOGY
2008年
5期
349-358
,共10页
孙斌%任道全%张青岩%邱义兰%刘如石%郭向荣
孫斌%任道全%張青巖%邱義蘭%劉如石%郭嚮榮
손빈%임도전%장청암%구의란%류여석%곽향영
FRET%单分子探针%Rac1%Cdc42%诱导激活
FRET%單分子探針%Rac1%Cdc42%誘導激活
FRET%단분자탐침%Rac1%Cdc42%유도격활
Rho家族鸟苷三磷酸酶.包括Rac1和Cdc42等,参与调节细胞形态、细胞迁移、转录激活和基因表达等一系列细胞过程.根据FRET(Fluorescent resonance energy transfer)技术原理,构建了包含红色荧光蛋白dsRed1与青色荧光蛋白ECFP的全长cDNA,效应分子Pak1或N-WASP的GTP酶联结区域,信号分子Rac1或Cdc42的全长cDNA的几种单分子探针.转染NIH3T3或Hela细胞,以胰岛素、缓激肽为诱导剂,分别激活Rac1、Cdc42信号转导通路.离体荧光光谱检测表明,在两种转染动物细胞中均产生了FRET现象.不同信号转导通路的FRET效率,在诱导激活5min后,均达到最高值,但增加幅度有显著差异.随着诱导时间的延长,FRET效率下降,但下降速率在不同信号转导通路间差异显著.Rac1、Cdc42激活试验证实,诱导激活的转染细胞中.Rac1、Cdc42均处于激活状态(GTP-bound),其在不同诱导时间的相对激活程度与FRET效率表现相同.诱导激活的Rac1、Cdc42信号转导通路,分别导致了转染活细胞中片状伪足、线状伪足的产生.这表明,采用这些单分子探针,可直接监测激活的信号转导通路,在活细胞中的3D时空分布变化图像及其产生的细胞学效应.采用这些单分子探针,分析、判断了一些调节蛋白对Rac1、Cdc42的GEF或GAP特性,从而提供一种可大大简化现有的鉴定待测蛋白分子的方法.
Rho傢族鳥苷三燐痠酶.包括Rac1和Cdc42等,參與調節細胞形態、細胞遷移、轉錄激活和基因錶達等一繫列細胞過程.根據FRET(Fluorescent resonance energy transfer)技術原理,構建瞭包含紅色熒光蛋白dsRed1與青色熒光蛋白ECFP的全長cDNA,效應分子Pak1或N-WASP的GTP酶聯結區域,信號分子Rac1或Cdc42的全長cDNA的幾種單分子探針.轉染NIH3T3或Hela細胞,以胰島素、緩激肽為誘導劑,分彆激活Rac1、Cdc42信號轉導通路.離體熒光光譜檢測錶明,在兩種轉染動物細胞中均產生瞭FRET現象.不同信號轉導通路的FRET效率,在誘導激活5min後,均達到最高值,但增加幅度有顯著差異.隨著誘導時間的延長,FRET效率下降,但下降速率在不同信號轉導通路間差異顯著.Rac1、Cdc42激活試驗證實,誘導激活的轉染細胞中.Rac1、Cdc42均處于激活狀態(GTP-bound),其在不同誘導時間的相對激活程度與FRET效率錶現相同.誘導激活的Rac1、Cdc42信號轉導通路,分彆導緻瞭轉染活細胞中片狀偽足、線狀偽足的產生.這錶明,採用這些單分子探針,可直接鑑測激活的信號轉導通路,在活細胞中的3D時空分佈變化圖像及其產生的細胞學效應.採用這些單分子探針,分析、判斷瞭一些調節蛋白對Rac1、Cdc42的GEF或GAP特性,從而提供一種可大大簡化現有的鑒定待測蛋白分子的方法.
Rho가족조감삼린산매.포괄Rac1화Cdc42등,삼여조절세포형태、세포천이、전록격활화기인표체등일계렬세포과정.근거FRET(Fluorescent resonance energy transfer)기술원리,구건료포함홍색형광단백dsRed1여청색형광단백ECFP적전장cDNA,효응분자Pak1혹N-WASP적GTP매련결구역,신호분자Rac1혹Cdc42적전장cDNA적궤충단분자탐침.전염NIH3T3혹Hela세포,이이도소、완격태위유도제,분별격활Rac1、Cdc42신호전도통로.리체형광광보검측표명,재량충전염동물세포중균산생료FRET현상.불동신호전도통로적FRET효솔,재유도격활5min후,균체도최고치,단증가폭도유현저차이.수착유도시간적연장,FRET효솔하강,단하강속솔재불동신호전도통로간차이현저.Rac1、Cdc42격활시험증실,유도격활적전염세포중.Rac1、Cdc42균처우격활상태(GTP-bound),기재불동유도시간적상대격활정도여FRET효솔표현상동.유도격활적Rac1、Cdc42신호전도통로,분별도치료전염활세포중편상위족、선상위족적산생.저표명,채용저사단분자탐침,가직접감측격활적신호전도통로,재활세포중적3D시공분포변화도상급기산생적세포학효응.채용저사단분자탐침,분석、판단료일사조절단백대Rac1、Cdc42적GEF혹GAP특성,종이제공일충가대대간화현유적감정대측단백분자적방법.
