现代免疫学
現代免疫學
현대면역학
CURRENT IMMUNOLOGY
2005年
6期
470-475
,共6页
杨明峰%陈永井%张光波%毛一香%瞿秋霞%张学光
楊明峰%陳永井%張光波%毛一香%瞿鞦霞%張學光
양명봉%진영정%장광파%모일향%구추하%장학광
逆转录病毒%载体构建%稳定表达%筛选
逆轉錄病毒%載體構建%穩定錶達%篩選
역전록병독%재체구건%은정표체%사선
构建高效的逆转录病毒载体pSIV-1,并对其功能进行初步鉴定.对pEGZ-Term、pLXSN、pGEx-5X-3等各类表达载体的调控元件进行分析后,运用分子生物学手段去除表达载体pEGZ-Term中的部分元件,定向插入启动子SV40、选择性标志G418、多克隆酶切位点等,从而获得一种新型逆转录病毒载体pSIV-1.运用新载体构建含人PD-L1基因片段的重组载体,并用脂质体转染法,将其转染至包装细胞系293T.收集含重组病毒的上清转染L929细胞,用含G418的培养液筛选,成活细胞经流式细胞仪检测到目的蛋白后,扩大培养,从而获得L929/PD-L1基因转染细胞.L929/PD-L1基因转染细胞与活化T细胞体外混合培养,观察PD-L1信号对T细胞活化后表达CD25、CD69的影响.结果,成功构建了pSIV-1逆转录病毒载体;酶切图谱分析与理论值一致;基因转染细胞能持续稳定高表达PD-L1,筛选时间较短,感染效率较高;PD-L1基因转染细胞能显著抑制T细胞的进一步活化.因此构建成一种新型高效逆转录病毒载体pSIV-1,为构建基因转染,并开展相关功能学研究奠定了良好的物质基础.
構建高效的逆轉錄病毒載體pSIV-1,併對其功能進行初步鑒定.對pEGZ-Term、pLXSN、pGEx-5X-3等各類錶達載體的調控元件進行分析後,運用分子生物學手段去除錶達載體pEGZ-Term中的部分元件,定嚮插入啟動子SV40、選擇性標誌G418、多剋隆酶切位點等,從而穫得一種新型逆轉錄病毒載體pSIV-1.運用新載體構建含人PD-L1基因片段的重組載體,併用脂質體轉染法,將其轉染至包裝細胞繫293T.收集含重組病毒的上清轉染L929細胞,用含G418的培養液篩選,成活細胞經流式細胞儀檢測到目的蛋白後,擴大培養,從而穫得L929/PD-L1基因轉染細胞.L929/PD-L1基因轉染細胞與活化T細胞體外混閤培養,觀察PD-L1信號對T細胞活化後錶達CD25、CD69的影響.結果,成功構建瞭pSIV-1逆轉錄病毒載體;酶切圖譜分析與理論值一緻;基因轉染細胞能持續穩定高錶達PD-L1,篩選時間較短,感染效率較高;PD-L1基因轉染細胞能顯著抑製T細胞的進一步活化.因此構建成一種新型高效逆轉錄病毒載體pSIV-1,為構建基因轉染,併開展相關功能學研究奠定瞭良好的物質基礎.
구건고효적역전록병독재체pSIV-1,병대기공능진행초보감정.대pEGZ-Term、pLXSN、pGEx-5X-3등각류표체재체적조공원건진행분석후,운용분자생물학수단거제표체재체pEGZ-Term중적부분원건,정향삽입계동자SV40、선택성표지G418、다극륭매절위점등,종이획득일충신형역전록병독재체pSIV-1.운용신재체구건함인PD-L1기인편단적중조재체,병용지질체전염법,장기전염지포장세포계293T.수집함중조병독적상청전염L929세포,용함G418적배양액사선,성활세포경류식세포의검측도목적단백후,확대배양,종이획득L929/PD-L1기인전염세포.L929/PD-L1기인전염세포여활화T세포체외혼합배양,관찰PD-L1신호대T세포활화후표체CD25、CD69적영향.결과,성공구건료pSIV-1역전록병독재체;매절도보분석여이론치일치;기인전염세포능지속은정고표체PD-L1,사선시간교단,감염효솔교고;PD-L1기인전염세포능현저억제T세포적진일보활화.인차구건성일충신형고효역전록병독재체pSIV-1,위구건기인전염,병개전상관공능학연구전정료량호적물질기출.
