CAJ | 학술논문

目的研究对氧磷酶与心血管疾病的关系.方法采用BAC-TO-BAC杆状病毒系统表达Q型人血清对氧磷酶(PON-1),在已获得人PON-1全长cDNA的基础上,通过PCR扩增,得到上游含EcoRⅠ酶切位点,下游不含终止密码子而含HindⅢ酶切位点的PON-1基因,将其克隆到带有6×His@Tag的pFASTBACⅡCD14质粒中,构建杆状病毒转移载体pFASTBACⅡ-PON-1.将含有PON-1基因的重组质粒pFASTBACⅡ-PON-1转化DH10BAC感受态细胞,使目的基因通过同源重组插入Bacmid DNA中.PCR鉴定正确后再转染入sf9昆虫细胞中,产生有感染力的重组杆状病毒.用乙酸苯酯为底物测定表达上清液中的酶活性.结果比较不同感染复数(MOI)和不同感染时间PON-1在培养上清液中的表达情况,确定感染复数MOI为6～8,感染时间96～108 h为PON-1的最佳表达条件,产率约为4.5 mg@L-1上清液.免疫印迹法表明重组蛋白有与抗6×His单克隆抗体结合的抗原性.顺磁共振实验证明,基因工程产人重组血清对氧磷酶rhPON-1能有效清除Fe2+诱导亚油酸脂质过氧化产生的脂质自由基,清除率为55.9%.结论BAC-TO-BAC杆状病毒介导的草地贪夜蛾昆虫细胞sf9可高效表达Q型人血清对氧磷酶.
목적연구대양린매여심혈관질병적관계.방법채용BAC-TO-BAC간상병독계통표체Q형인혈청대양린매(PON-1),재이획득인PON-1전장cDNA적기출상,통과PCR확증,득도상유함EcoRⅠ매절위점,하유불함종지밀마자이함HindⅢ매절위점적PON-1기인,장기극륭도대유6×His@Tag적pFASTBACⅡCD14질립중,구건간상병독전이재체pFASTBACⅡ-PON-1.장함유PON-1기인적중조질립pFASTBACⅡ-PON-1전화DH10BAC감수태세포,사목적기인통과동원중조삽입Bacmid DNA중.PCR감정정학후재전염입sf9곤충세포중,산생유감염력적중조간상병독.용을산분지위저물측정표체상청액중적매활성.결과비교불동감염복수(MOI)화불동감염시간PON-1재배양상청액중적표체정황,학정감염복수MOI위6～8,감염시간96～108 h위PON-1적최가표체조건,산솔약위4.5 mg@L-1상청액.면역인적법표명중조단백유여항6×His단극륭항체결합적항원성.순자공진실험증명,기인공정산인중조혈청대양린매rhPON-1능유효청제Fe2+유도아유산지질과양화산생적지질자유기,청제솔위55.9%.결론BAC-TO-BAC간상병독개도적초지탐야아곤충세포sf9가고효표체Q형인혈청대양린매.