中国医学科学院学报
中國醫學科學院學報
중국의학과학원학보
ACTA ACADEMIAE MEDICINAE SINICAE
2002年
6期
588-591
,共4页
姚旭东%马腾骧%吴志宏%李胜芝%李志欣%王广有
姚旭東%馬騰驤%吳誌宏%李勝芝%李誌訢%王廣有
요욱동%마등양%오지굉%리성지%리지흔%왕엄유
启动子%重组%遗传%转基因
啟動子%重組%遺傳%轉基因
계동자%중조%유전%전기인
目的构建含人粘附分子-2(ICAM-2)启动子的人补体调节蛋白CD59重组基因,并将其用于异种器官移植转基因.方法利用PCR方法从人血基因组扩增得到ICAM-2启动子、CD59基因的第一内含子片段,经电泳分离、切胶回收纯化得到上述片段,分别双酶、单酶切这两条片段,纯化回收备用;双酶切pcDNA3-CD59真核表达载体,经电泳分离、切胶回收纯化得到不含病毒启动子、含筛选基因Neo的一段pcDNA3-CD59cDNA作为载体序列;ICAM-2启动子片段先与载体进行定向克隆连接反应后转化细菌,阳性转化菌质粒抽提及酶切鉴定,得到pcDNA3-ICAM2-CD59质粒;再单酶切此质粒,纯化该载体与CD59第一内含子片段连接,转化细菌、抽提质粒,用脂质体将该质粒转染猪血管内皮细胞,流式细胞仪检测CD59蛋白表达.结果得到pcDNA3-Enhancer-ICAM2-CD59质粒,以EcoR Ⅰ消化此重组质粒,产生5.5及0.5kb两片段;以HindⅢ消化重组质粒,得到5.45及0.55kb两片段,以Kpn Ⅰ/HindⅢ双酶切质粒时,出现5.0、0.55、0.4kb3条片段,对插入子分别进行测序,上述结果完全符合设计要求及正确序列.流式细胞仪检测重组基因表达阳性.结论含人ICAM-2启动子的CD59重组基因表达载体获得成功,该重组基因构建成功为转基因应用奠定了基础.
目的構建含人粘附分子-2(ICAM-2)啟動子的人補體調節蛋白CD59重組基因,併將其用于異種器官移植轉基因.方法利用PCR方法從人血基因組擴增得到ICAM-2啟動子、CD59基因的第一內含子片段,經電泳分離、切膠迴收純化得到上述片段,分彆雙酶、單酶切這兩條片段,純化迴收備用;雙酶切pcDNA3-CD59真覈錶達載體,經電泳分離、切膠迴收純化得到不含病毒啟動子、含篩選基因Neo的一段pcDNA3-CD59cDNA作為載體序列;ICAM-2啟動子片段先與載體進行定嚮剋隆連接反應後轉化細菌,暘性轉化菌質粒抽提及酶切鑒定,得到pcDNA3-ICAM2-CD59質粒;再單酶切此質粒,純化該載體與CD59第一內含子片段連接,轉化細菌、抽提質粒,用脂質體將該質粒轉染豬血管內皮細胞,流式細胞儀檢測CD59蛋白錶達.結果得到pcDNA3-Enhancer-ICAM2-CD59質粒,以EcoR Ⅰ消化此重組質粒,產生5.5及0.5kb兩片段;以HindⅢ消化重組質粒,得到5.45及0.55kb兩片段,以Kpn Ⅰ/HindⅢ雙酶切質粒時,齣現5.0、0.55、0.4kb3條片段,對插入子分彆進行測序,上述結果完全符閤設計要求及正確序列.流式細胞儀檢測重組基因錶達暘性.結論含人ICAM-2啟動子的CD59重組基因錶達載體穫得成功,該重組基因構建成功為轉基因應用奠定瞭基礎.
목적구건함인점부분자-2(ICAM-2)계동자적인보체조절단백CD59중조기인,병장기용우이충기관이식전기인.방법이용PCR방법종인혈기인조확증득도ICAM-2계동자、CD59기인적제일내함자편단,경전영분리、절효회수순화득도상술편단,분별쌍매、단매절저량조편단,순화회수비용;쌍매절pcDNA3-CD59진핵표체재체,경전영분리、절효회수순화득도불함병독계동자、함사선기인Neo적일단pcDNA3-CD59cDNA작위재체서렬;ICAM-2계동자편단선여재체진행정향극륭련접반응후전화세균,양성전화균질립추제급매절감정,득도pcDNA3-ICAM2-CD59질립;재단매절차질립,순화해재체여CD59제일내함자편단련접,전화세균、추제질립,용지질체장해질립전염저혈관내피세포,류식세포의검측CD59단백표체.결과득도pcDNA3-Enhancer-ICAM2-CD59질립,이EcoR Ⅰ소화차중조질립,산생5.5급0.5kb량편단;이HindⅢ소화중조질립,득도5.45급0.55kb량편단,이Kpn Ⅰ/HindⅢ쌍매절질립시,출현5.0、0.55、0.4kb3조편단,대삽입자분별진행측서,상술결과완전부합설계요구급정학서렬.류식세포의검측중조기인표체양성.결론함인ICAM-2계동자적CD59중조기인표체재체획득성공,해중조기인구건성공위전기인응용전정료기출.
